本发明专利技术公开了缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记及其扩增引物和应用，特点是运用高通量测序技术和生物信息学分析手段筛选到24个位于ABC转运蛋白家族基因上的SNP位点对缢蛏抗副溶血弧菌感染具有显著相关性，通过引物设计和高分辨率熔解曲线分型技术可对其中的6个SNP位点进行分型，6个SNP标记优势等位基因，其SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:6所示，并公开了其扩增引物以及该分子标记在缢蛏抗副溶血弧菌亲本选育中的应用，优点是快速、准确、有效地利用SNP标记检测缢蛏抗病个体，为缢蛏抗病品系标记辅助选育工作提供了可靠的分子标记。
Molecular Markers of Anti-Vibrio parahaemolyticus Related SNPs and Their Amplified Primers and Applications in Vermicularis constricta
【技术实现步骤摘要】
缢蛏抗副溶血弧菌相关SNPs分子标记及其扩增引物和应用
本专利技术属于分子生物学DNA标记技术，具体涉及缢蛏抗副溶血弧菌相关基因腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的SNPs分子标记及其扩增引物和应用。
技术介绍
缢蛏（Sinonovaculaconstricta）是一种广温广盐的滩涂贝类，是我国四大养殖贝类之一，在我国沿海自北向南均有分布，然而数代的繁育养殖导致近交衰退，缢蛏种质逐年下降，在养殖过程中面临着生长速度变缓、抗逆性不强、病害增多、产品质量下降等诸多问题，且呈现愈演愈烈的趋势。近年来，随着持续的集约化养殖，蛏病的发生日益频繁，大批死亡现象时有发生，对缢蛏的养殖产业造成了一定的破坏性影响。因此，进行缢蛏遗传改良，培育具有优质、高产、抗病等优良性状的新品种，已成为缢蛏养殖业亟待解决的问题。腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-bindingcassettetransporter，ABC转运蛋白）是一类广泛分布在原核和真核生物中并具有多种功能的膜蛋白超级家族，其主要功能是利用ATP水解产生的能量进行逆浓度梯度跨膜转运过程。ABC转运蛋白的底物类型涵盖有机、无机小分子和部分有机大分子化合物，在细胞解毒、脂质稳态、信号转导、病害防御以及抗原呈递等生理过程中都有参与。在双壳贝类的研究中发现，ABC转运戴白有助于组织渗透性选择并防御异物渗透，其介导的异生物质抗性机制已被证明是防止环境毒物的第一道防线。在病原感染过程中，ABC转运蛋白在双壳贝类鳃组织表面形成了组织-环境的选择性屏障，参与机体的免疫反应，因此ABC转运蛋白相当于缢蛏抗病抗逆的第一道防线。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，具有密度高、分布广、共显性和可稳定遗传等特点，是目前最具发展潜力的分子标记。随着测序和芯片技术的高速发展，SNP标记已被广泛应用于高密度遗传连锁图谱构建、数量性状精细定位以及全基因组关联分析等研究中。分子标记辅助育种正是利用分子标记与养殖品种的性状相关联，从而实现基因水平的选择育种，克服传统方法育种效率低且受人为因素影响大的缺点，大大提高选择的准确性和育种周期。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、准确、有效地利用SNP标记检测缢蛏抗病个体的缢蛏抗副溶血弧菌相关SNPs分子标记及其扩增引物和应用本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记，其通过高通量测序技术，从30个缢蛏个体中筛选了1,048,576个SNPs位点，其中15个为敏感群体，15个为抗病群体，通过卡方检验分析基因型与抗病性状的显著性差异，共在ABC转运蛋白家族中发现了24个与缢蛏抗副溶血弧菌性状显著相关的SNPs位点，其中可有效分型的为6个，分别为：第一个SNP标记命名Sc3488，其位于unigene0003488的第583个碱基处，突变类型为：G/A，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示第二个SNP标记命名Sc15480，其位于unigene0015480的第513个碱基处，突变类型为：A/G；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示第三个SNP标记命名Sc21269，其位于unigene0021269的第504个碱基处，突变类型为：G/T；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示第四个SNP标记命名Sc30664，其位于unigene0030664的第609个碱基处，突变类型为：C/T；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:4所示第五个SNP标记命名Sc39666，其位于unigene0039666的第1396个碱基处，突变类型为：G/A；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5所示第六个SNP标记命名Sc60136，其位于unigene0060136的第88个碱基处583，突变类型为：A/G；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:6所示上述缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记的扩增引物，6个SNP标记的扩增引物分别为：Sc3488-F:GCTATGGGGAGAAGCTCAAAGT，Sc3488-R:AGCCACCGATCACCAGACGT；Sc15480-F:TGTATGAATCCTGGAGAAAAGC，Sc15480-R:GTCCGAGTCCCTACGGCTTG；Sc21269-F:CTCTGTCACAGCCTTCCATTAC，Sc21269-R:AGAGTTTGAGCACAGAAAGATTG；Sc30664-F:CTTTGTGCGCCATTCAGTG，Sc30664-R:CATCATCATCGCCATCGTGT；Sc39666-F:TGGAAACCGAAGGAGCTAC，Sc39666-R:TGAACAAACCCAATGAGC；Sc60136-F:GGTCGCACAGCCTGAATGAT，Sc60136-R:TATGTTTGCGGGAAAGACCAC。上述缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记的筛选方法，包括以下步骤：1）实验群体的获得：以缢蛏养殖群体为繁殖亲本，通过连续数代选育的缢蛏快速生长品系“甬乐一号”为实验样本；利用终浓度为5×107CFU/mL的副溶血弧菌处理15天，死亡个体为敏感群体，存活个体为抗病群体；2）从两个群体中各筛选15个个体进行转录组测序，对测序结果进行SNP筛选，保留具有多态性且等位基因频率在50%以上的SNP位点，运用卡方检验分析SNP位点在敏感群体和抗病群体中相关性，初步筛选出24个SNP位点与抗病性状相关联，即P值<0.05；3)对上述筛选的SNP位点设计引物，并在实验群体中进行验证，利用HRM技术，最终有6个SNP标记可以准确分型，经卡方检验其与抗病性状显著关联，即P值<0.05；6个SNP位点的优势等位基因为Sc3488位点的等位基因（A）、Sc15480位点的等位基因（G）、Sc21269位点的等位基因（T）、Sc30664位点的等位基因（C）、Sc39666位点的等位基因（G）和Sc60136位点的等位基因（A）。上述缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs标记在筛选缢蛏抗副溶血弧菌亲本中的应用。具体为：检测缢蛏亲本同时存在所述的Sc3488位点的等位基因（A）、Sc15480位点的等位基因（G）、Sc21269位点的等位基因（T）、Sc30664位点的等位基因（C）、Sc39666位点的等位基因（G）、Sc60136位点的等位基因（A），可被选为抗副溶血弧菌亲本。具体步骤如下：1）从待测亲本中剪取鳃组织，提取RNA，并反转为cDNA；2）以提取的cDNA为模板，利用所述的6个SNP标记的引物进行PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析技术对每个亲本样品进行基因分型，将存在Sc3488位点的等位基因（A）、Sc15480位点的等位基因（G）、Sc21269位点的等位基因（T）、Sc30664位点的等位基因（C）、Sc39666位点的等位基因（G）、Sc60136位点的等位基因（A）的个体保留，即为缢蛏抗副溶血弧菌亲本。利用本方法将生产中具有以上优势等位基因的个体选作亲本，可实现在早期鉴定出具有较高抗病能力的个体，从而缩短育种周期，加快育种进程。与现有技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记，其特征在于所述的分子标记位于ABC转运蛋白基因家族中，所述的分子标记分别为：第一个SNP标记命名Sc3488，其位于unigene0003488的第583个碱基处，突变类型为：G/A，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，第二个SNP标记命名Sc15480，其位于unigene0015480的第513个碱基处，突变类型为：A/G；其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，第三个SNP标记命名Sc21269，其位于unigene0021269的第504个碱基处，突变类型为：G/T；其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，第四个SNP标记命名Sc30664，其位于unigene0030664的第609个碱基处，突变类型为：C/T；其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，第五个SNP标记命名Sc39666，其位于unigene0039666的第1396个碱基处，突变类型为：G/A；其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，第六个SNP标记命名Sc60136，其位于unigene0060136的第88个碱基处583，突变类型为：A/G；其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示。...
【技术特征摘要】
1.一种缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记，其特征在于所述的分子标记位于ABC转运蛋白基因家族中，所述的分子标记分别为：第一个SNP标记命名Sc3488，其位于unigene0003488的第583个碱基处，突变类型为：G/A，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，第二个SNP标记命名Sc15480，其位于unigene0015480的第513个碱基处，突变类型为：A/G；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示，第三个SNP标记命名Sc21269，其位于unigene0021269的第504个碱基处，突变类型为：G/T；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示，第四个SNP标记命名Sc30664，其位于unigene0030664的第609个碱基处，突变类型为：C/T；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:4所示，第五个SNP标记命名Sc39666，其位于unigene0039666的第1396个碱基处，突变类型为：G/A；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5所示，第六个SNP标记命名Sc60136，其位于unigene0060136的第88个碱基处583，突变类型为：A/G；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:6所示。2.权利要求1所述的缢蛏抗副溶血弧菌相关的SNPs分子标记的扩增引物，其特征在于6个SNP标记的扩增引物分别为：Sc3488-F:GCTATGGGGAGAAGCTCAAAGT，Sc3488-R:AGCCACCGATCACCAGACGT；Sc15480-F:TGTATGAATCCTGGAGAAAAGC，Sc15480-R:GTCCGAGTCCCTACGGCTTG；Sc21269-F:CTCTGTCACAGCCTTCCATTAC，Sc21269-R:AGAGTTTGAGCACAGAAAGATTG；Sc30664-F:CTTTGTGCGCCATTCAGTG，Sc30664-R:CATCATCATCGCCATCGTGT；Sc39666-F:TGGAAACCGAAGGAGCTAC，Sc39666-R:TGAACAAACCCAATGAGC；Sc60136-F:GGTCGCACAGCCTGAATGAT，Sc60136-R:TATGTTTGCGGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：李成华，赵雪琳，伏建平，邵铱娜，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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