鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选育中的应用技术

本发明专利技术公开了一种鸡MMP‑11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状育种中的应用。本发明专利技术首次发现了鸡MMP‑11基因5′调控区存在3个突变位点，即g.‑889(C>T)、g.‑636(A>G)和g.‑518(C>T)位点，其中g.‑889(C>T)、g.‑636(A>G)两个SNP位点与鸡的开产日龄和30周龄前期产蛋数性状存在显著关联，CA/CA基因型对应较小的开产日龄和较高的早期产蛋数。而TG/TG基因型个体对应开产晚，可见检测这2个与性成熟性状相关联的分子标记位点，有助于选育性早熟品种/系，为鸡育种工作特别是对性成熟较晚的地方鸡种提供有利的帮助，同时为分子标记辅助育种芯片定制提供准确有效的标记位点。

Molecular Marker Method for Two Mutation Loci in 5'Regulatory Region of Chicken MMP-11 Gene and Its Application in Selection of Chicken Sexual Precocity Traits

【技术实现步骤摘要】
鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选育中的应用
本专利技术涉及分子遗传学
，具体涉及一种鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状育种中的应用。
技术介绍
基质金属蛋白酶(MMPs)是一类依赖锌离子的蛋白水解酶，可以降解细胞外基质、基底膜、以及间质基质，在卵巢卵泡的发育中具有重要作用，MMPs是参与细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)降解和重建的主要蛋白酶系统(Goldmanetal.,2004)。MMPs协同其组织抑制因子TIMP以及其它细胞因子在卵泡生长、排卵、闭锁和退化等生物学过程中发挥重要调控作用，成为当前繁殖系统研究的新领域(Littlepageetal.,2010；Margherietal.,2009)。MMP-11属于MMPs家族，并具有一些独特的特性，MMP-11能降解非细胞外基质的丝氨酸蛋白酶抑制剂、α1抗胰蛋白酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-1；而且MMP-11以45kDa的活化酶形式在细胞内释放(Massovaetal.,1998)。区别于MMPs家族其他成员，MMP-11结构域含有一个转化酶furin的识别位点，MMP-11和多数MT-MMPs在细胞内被细胞内蛋白酶激活，以活性的形式分泌到细胞外，而大多数MMPs以无活性的酶原形式分泌到细胞外，在细胞外得以激活。MMP-11有一个信号肽序列，由17-29个氨基酸组成，其作用是引导翻译后的新生肽至胞浆内质网。MMP-11的C末端有一个血红素结合蛋白样结构域，参与大分子底物的识别以及同组织金属蛋白酶抑制剂的结合。目前对于MMP-11的研究主要集中在对胃癌、喉鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌的调控等方面。还未见有MMP-11与卵巢发育相关的报道。分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影响和年龄限制，从而加速育种过程及精准度。基因表达转录受5′调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。因此，研究鸡MMP-11基因的5′调控区的SNPs，旨在找到与性成熟相关的有效的分子标记，为鸡的性早熟性状的分子标记辅助选择育种提供有利的理论依据。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状育种中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种鸡MMP-11基因5′调控区与性成熟性状关联的突变位点分子标记方法，其具体标记方法是：采用标记引物P-MMP-11，包括：P-MMP-11-F，其序列如SEQIDNO.1所示；P-MMP-11-R，其序列如SEQIDNO.2所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如SEQIDNO.3所示，结果在MMP-11基因5'调控区检测到三个突变位点，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点，其中g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个突变位点与鸡的性早熟性状关联显著。本专利技术的第二方面，提供一组与鸡产蛋性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记来自MMP-11基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；SEQIDNO.3所示序列自5′端起第178位碱基是C或T，第431位碱基是A或G。进一步的，所述SNP分子标记的g.-889(C>T)位点CC基因型和g.-636(A>G)位点的AA基因型个体对应较小的开产日龄和较多的30周龄早期产蛋数，他们的联合单倍型CA/CA基因型个体性状表现与单位点关联分析相一致，即表现为性成熟早。上述SNP分子标记在鸡遗传育种中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术的第三方面，提供用于检测上述SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本专利技术的第四方面，提供一种用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对。本专利技术的第五方面，提供上述引物对和/或试剂盒在辅助选育性早熟的鸡品种中的应用。本专利技术的第六方面，提供一种利用上述SNP分子标记辅助进行鸡性早熟育种的方法，包括以下步骤：在性成熟较晚的群体中，选择CA/CA纯合基因型公鸡和CA/CA纯合基因型的母鸡通过相互交配得到CA/CA基因型，即得到性成熟早的群体；所述CA基因型是指MMP-11基因5'调控区-889和-636位点分别为C和A碱基。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次发现了鸡MMP-11基因5′调控区存在三个突变位点，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点，其中g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个位点与鸡的开产日龄和30周龄早期产蛋数性状存在显著关联；开产日龄和早期产蛋数是两个存在显著负相关的性状，即开产日龄小则早期产蛋数多。g.-889(C>T)位点的CC基因型以及g.-636(A>G)位点AA基因型个体具有较小的开产日龄和较多的30周产蛋数，两位点单倍型组合分析也发现CA/CA基因型对应较小的开产日龄较高的早期产蛋数。可见检测这2个与开产性状相关联的分子标记位点，有助于选育性早熟的品系，为鸡育种工作特别是对性成熟较晚的地方鸡种提供有利的帮助。(2)利用本专利技术的SNP分子标记辅助进行鸡选择育种，得到的CA/CA基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在开产较晚的地方鸡群体中有意增加CA/CA基因型的频率，这样的措施会使其开产提前，从而降低饲养成本。附图说明图1：P-MMP-11-F/R引物扩增的PCR片段电泳图。图2：鸡MMP-11基因5′调控区g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点(正向)位点的多态性测序图。图3：三个多态位点在济宁百日鸡群体中的连锁关系图。图4MMP-11基因5′调控区不同删除载体片段启动活性检测示意图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。术语说明：SNP(singlenucleotidepolymorphism，SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。正如
技术介绍
部分介绍的，基因表达转录受5′调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。本专利技术前期利用RNA-seq技术筛选鸡卵巢中性成熟差异表达基因时，发现MMP家族多个成员包括MMP11基因的表达存在显著差异。因此，本专利技术重点研究鸡MMP-11基因的5′调控区的SNPs，旨在找到与性成熟相关的有效的分子标记，为鸡的性早熟性状的分子标记辅助选择育种提供有利的理论依据。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡MMP‑11基因5′调控区与性成熟性状关联的突变位点分子标记方法，其特征在于，具体标记方法是：采用标记引物P‑MMP‑11，包括：P‑MMP‑11‑F，其序列如SEQ ID NO.1所示；P‑MMP‑11‑R，其序列如SEQ ID NO.2所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如SEQ ID NO.3所示，结果在MMP‑11基因5'调控区检测到三个突变位点，分别位于MMP11基因TSS上游889bp、636bp和518bp，即g.‑889(C>T)、g.‑636(A>G)和g.‑518(C>T)位点，其中g.‑889(C>T)和g.‑636(A>G)两个突变位点与性成熟性状存在显著关联。

【技术特征摘要】
1.一种鸡MMP-11基因5′调控区与性成熟性状关联的突变位点分子标记方法，其特征在于，具体标记方法是：采用标记引物P-MMP-11，包括：P-MMP-11-F，其序列如SEQIDNO.1所示；P-MMP-11-R，其序列如SEQIDNO.2所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如SEQIDNO.3所示，结果在MMP-11基因5'调控区检测到三个突变位点，分别位于MMP11基因TSS上游889bp、636bp和518bp，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点，其中g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个突变位点与性成熟性状存在显著关联。2.一组与鸡性成熟性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记来自MMP-11基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；SEQIDNO.3所示序列自5′端起第178位碱基是C或T，第431位...

【专利技术属性】
技术研发人员：康丽，凡方涛，姜运良，陈秀萍，侯立，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37