一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于固定化SNAP‑tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法，属于细胞膜色谱柱制备技术领域。该方法首先将苯甲基鸟嘌呤键合到硅胶上，然后利用SNAP‑tag与其底物苯甲基鸟嘌呤的高特异性识别和稳定共价结合使细胞膜固定苯甲基鸟嘌呤修饰的硅胶固定相表面，即得细胞膜色谱固定相，最后将混合固定相湿法装柱，构成基于固定化SNAP‑tag融合蛋白的细胞膜色谱柱。本发明专利技术制备的基于固定化SNAP‑tag融合蛋白的细胞膜色谱柱延长细胞膜色谱柱的柱寿命，提高其稳定性。解决了现有的细胞膜色谱柱存在特异性较差的问题，为细胞膜色谱柱的商品化奠定了基础。

A Cell Membrane Chromatographic Column Based on Immobilized SNAP-tag Fusion Protein and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法
本专利技术属于细胞膜色谱柱制备
，涉及一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法。
技术介绍
细胞膜色谱是一种有效的从复杂体系中直接筛选识别目标组分的新技术。但其作为一种新兴技术，不可避免的仍存在一定的缺陷，主要体现在两个方面：第一是细胞膜色谱柱的寿命有待进一步提升，作为生物亲和色谱方法的一种，细胞膜具有所有生物亲和色谱的通性特点，即生物材料维持活性较难，而且由于细胞膜与硅胶之间主要通过疏水作用相结合，因而其柱效降低较快，寿命往往较短，因为随着细胞膜色谱柱的使用，其上生物材料也就是细胞膜会逐渐脱落失活，导致其有效使用寿命往往不到72小时，这就大大阻碍了细胞膜色谱柱的商品化应用道路。第二是细胞膜色谱特异性较差，细胞膜色谱作为一种生物亲和色谱，其活性筛选功能是经由其上所搭载的生物活性材料，亦即细胞膜所实现的。而由于细胞膜表面受体众多，难以确定其上哪个蛋白靶点与潜在活性药物之间相互作用，这也对后期进行潜在活性成分的药理活性验证带来了不便。在众多生物分析和生物医学的研究领域中，蛋白质固定化发挥着越来越重要的作用，传统的蛋白质固定化方法(如非特异性物理吸附、亲和标签的非共价结合、选择性的酶共价结合等)往往存在特异性不好、结合力不稳定、靶蛋白功能可能受化学修饰的影响等问题。SNAP-tag凭借其与其底物苯甲基鸟嘌呤(benzylguanine,BG)的高特异性识别和稳定共价结合的性质，成为目前蛋白固定化最有力的工具。SNAP-tag是一种新型的自我标记标签蛋白，SNAP-tag无论在体内还是体外都可以特异性并快速与其配体，即苯甲基鸟嘌呤(benzylguanine,BG)衍生物发生反应，以共价键结合。苯甲基鸟嘌呤可事先固定在基质表面，然后混合提取液中的SNAP-tag融合蛋白即可特异性地与底物作用，形成共价键，从而使得融合蛋白间接固定在基质表面。但是，目前关于基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法等技术还鲜有报道。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法，该细胞膜色谱柱的柱寿命延长，稳定性提高，特异性强；该制备方法操作简单，易于实现。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱，该细胞膜色谱柱是将苯甲基鸟嘌呤键合到硅胶上，细胞膜上的SNAP-tag融合受体特异性结合苯甲基鸟嘌呤，使SNAP-tag融合蛋白固定在硅胶表面得到细胞膜固定相，再将细胞膜固定相采用湿法装柱制得。优选地，所述硅胶为氨基化硅胶。进一步优选地，苯甲基鸟嘌呤通过三聚氯氰键合到氨基化硅胶上。进一步优选地，所述氨基化硅胶为氨丙基硅胶。本专利技术还公开了一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱的制备方法，包括以下步骤：1)将3-氨丙基三乙氧基硅烷键合到硅胶上，制得氨丙基硅胶；2)采用三聚氯氰修饰氨丙基硅胶，制得三聚氯氰修饰的硅胶固定相；3)将三聚氯氰修饰的硅胶固定相制备成悬浮液，然后加入等摩尔的6-[[4-(氨基甲基)苯基]甲氧基]-7H-嘌呤-2-胺，充分搅拌反应，制备得到苯甲基鸟嘌呤修饰的硅胶固定相；4)培养SNAP-tag融合蛋白高表达细胞，当细胞计数不低于107个时，去除培养基，获得细胞，分离出细胞膜；5)将细胞膜配制成细胞膜悬液，将细胞膜悬液加入步骤3)制得的苯甲基鸟嘌呤修饰的硅胶固定相中，搅拌均匀后静置过夜，得到以苯甲基鸟嘌呤修饰的硅胶为载体的细胞膜固定相；6)将以苯甲基鸟嘌呤修饰的硅胶为载体的细胞膜固定相采用湿法装柱获得基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱。优选地，步骤1)中的硅胶使用前经活化处理。优选地，步骤4)中，将获得的细胞用Tris-HCl混悬后置于细胞超声破碎仪中进行破碎，然后通过差速离心分离细胞膜。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开的基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱将苯甲基鸟嘌呤共价键合到硅胶上，细胞膜上的SNAP-tag融合受体即可特异性地与底物作用，形成共价键，从而使得SNAP-tag融合蛋白间接固定在硅胶表面，一方面由于共价键合的方法实现细胞膜在硅胶上的固定，从而进一步延长细胞膜色谱柱的柱寿命，提高其稳定性。另一方面，由于靶标蛋白与SNAP-tag的融合，可特异性地与底物作用，即细胞膜色谱柱上只存在靶标受体，无其他受体的干扰，大大提高了其特异性。附图说明图1为固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱制备流程图；图2为氨基修饰硅胶(NH2-SiO2)，三聚氯氰修饰硅胶(TCT-SiO2)，苯甲基鸟嘌呤修饰硅胶(BG-SiO2)的红外谱图；图3为氨基修饰硅胶(NH2-SiO2)，三聚氯氰修饰硅胶(TCT-SiO2)，苯甲基鸟嘌呤修饰硅胶(BG-SiO2)的X射线光电子能谱图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，本专利技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本专利技术的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。下面结合附图对本专利技术做进一步详细描述：参见图1，本专利技术提供一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱及其制备方法。首先制备氨基键合硅胶，然后将三聚氯氰键合到氨基化硅胶上，作为苯甲基鸟嘌呤键合到硅胶上的linker，接下来细胞膜上的SNAP-tag融合受体即可特异性地与底物作用，形成共价键，从而使得融合蛋白间接固定在硅胶表面制得细胞膜固定相。再通过湿法装入色谱柱中，构成一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱。该固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱延长细胞膜色谱柱的柱寿命，提高其稳定性。解决了现有的细胞膜色谱柱存在特异性较差的问题，为细胞膜色谱柱的商品化奠定了基础。1、本专利技术中基于固定化SNAP-tag融合蛋白细胞膜色谱柱的制备，包括以下步骤：1)氨基键合硅胶固定相的制备称取大孔硅胶(型号：ZEX-II,5μm,)10g置于500mL圆底烧瓶内，加入1mol/L的盐酸水溶液200mL，超声处理30min后，使用电热套进行加热回流2h，将硅胶和盐酸溶液转移至1000mL烧杯内，加入超纯水至1000mL，搅拌均匀，让硅胶自由沉降，待沉降完毕后去除上清，重新加入1000mL的超纯水，重复4-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于固定化SNAP‑tag融合蛋白的细胞膜色谱柱，其特征在于，该细胞膜色谱柱是将苯甲基鸟嘌呤键合到硅胶上，细胞膜上的SNAP‑tag融合受体特异性结合苯甲基鸟嘌呤，使SNAP‑tag融合蛋白固定在硅胶表面得到细胞膜固定相，再将细胞膜固定相采用湿法装柱制得。

【技术特征摘要】
1.一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱，其特征在于，该细胞膜色谱柱是将苯甲基鸟嘌呤键合到硅胶上，细胞膜上的SNAP-tag融合受体特异性结合苯甲基鸟嘌呤，使SNAP-tag融合蛋白固定在硅胶表面得到细胞膜固定相，再将细胞膜固定相采用湿法装柱制得。2.根据权利要求1所述的基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱，其特征在于，所述硅胶为氨基化硅胶。3.根据权利要求2所述的基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱，其特征在于，苯甲基鸟嘌呤通过三聚氯氰键合到氨基化硅胶上。4.根据权利要求2所述的基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱，其特征在于，所述氨基化硅胶为氨丙基硅胶。5.一种基于固定化SNAP-tag融合蛋白的细胞膜色谱柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将3-氨丙基三乙氧基硅烷键合到硅胶上，制得氨丙基硅胶；2)采用三聚氯氰修饰氨丙基硅胶，制得三聚氯氰修饰的硅胶固定相；3)将三聚氯氰修饰的硅胶固定相...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺浪冲，韩省力，付佳，张涛，贺怀贞，林园园，吕艳妮，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61