检测抗CCP抗体的均相免疫检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗‑CCP抗体均相免疫检测试剂盒。该试剂盒采用高灵敏度和特异性瓜氨酸化牛血清白蛋白作为抗原，结合能够区分出免疫复合物状态下的抗体和非特异性抗体、未结合抗原的游离的特异性抗体的抗免疫复合物抗体和光激化学发光技术制成。该试剂盒在检测过程中不受非特异性抗体的干扰而可以省略传统间接法中需要洗涤的过程。该试剂盒特异性高、灵敏度好、线性范围宽、反应速度快、操作简便，并可实现全自动化高通量测试。

Homogeneous Immunoassay Kit for Detecting Anti-CCP Antibody and Its Application

【技术实现步骤摘要】
检测抗CCP抗体的均相免疫检测试剂盒及其应用
本专利技术属于免疫分析
，具体涉及一种检测抗-CCP抗体的均相免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法。
技术介绍
抗环瓜氨酸肽(Anticycliccitrullinatedpeptideantibodies，抗CCP)抗体是一种新型的血清标志物，临床检验实践表明，抗-CCP抗体的滴度通常和疾病的活动度相关，70-80％患者在疾病很早期就在血清和滑膜液中出抗-CCP抗体，此抗体具有高度的特异性和一定的预后价值。目前国内外市场上的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒主要应用酶联免疫吸附法(ELISA法)，然而该方法检测背景值较高、灵敏度较低、线性范围窄、易产生假阳性的实验结果；同时针对检测不同亚型的抗体，需要采用相应的酶标二抗进行检测，实验操作较为繁琐。因此，为了克服现有检测技术中存在的上述缺陷，需要研究开发出一种抗原特异性强、信号放大效果好、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、测试更稳定的用于检测抗-CCP抗体的均相免疫化学发光检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测待测样本中抗-CCP抗体的免疫测定方法及其在间接均相免疫检测人血清或血浆中抗-CCP抗体中的应用。所述方法采用一种特异性识别人免疫复合物的抗免疫复合物抗体，该抗体的特异性识别性能较高，利用该抗体实现了间接法在均相免疫检测平台中的应用。为此，本专利技术第一方面提供了一种用于检测抗-CCP抗体的均相免疫检测试剂套装，其包括：组分a，其包含能够与抗-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合的第一抗原；组分b，其包含抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。本专利技术中，所述第一抗原或所述抗免疫复合物抗体与受体相结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。在本专利技术的一些实施例中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。根据本专利技术，所述试剂套装还包含组分c，其包含能够在激发状态产生单线态氧的供体。在本专利技术的一些实施例中所述供体与特异性结合配对成员中的一员结合，而特异性结合配对成员中的另一员与所述第一抗原或所述抗免疫复合物抗体结合。在本专利技术的一些具体优选的实施例中，所述供体与链霉亲和素结合，相应地第一抗原或所述抗免疫复合物抗体与生物素结合。在本专利技术的一些实施例中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。在本专利技术中，所述抗免疫复合物抗体通过识别表位与第一免疫复合物中的抗-CCP抗体结合，所述识别表位是构象表位和/或线性表位。在本专利技术的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的恒定区部分。在本专利技术的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体不识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的轻链部分。在本专利技术的另一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体特异性识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的Fc段。在本专利技术的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述抗免疫复合物抗体为单克隆抗体。在本专利技术中，所述多克隆抗体的制备方法包括：用人免疫复合物对动物进行免疫，获取含有所述多克隆抗体的动物血清；所述动物血清经亲和层析纯化得到特异性识别人免疫复合物的多克隆抗体。在本专利技术中，所述单克隆抗体的制备方法包括：将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行培养，对细胞培养上清液进行检测，保留阳性细胞株。在本专利技术的一些实施方式中，所述第一抗原选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述第一抗原选自合成的含环瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述第一抗原为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。在本专利技术的一些优选的实施例中，所述含瓜氨酸的肽段选自SEQIDNo.1-4。在本专利技术的一些进一步优选的实施方式中，所述第一抗原通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。在本专利技术的一些实施例中，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。在本专利技术的另一些实施例中，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。在本专利技术的一些实施例中，所述受体及与之结合的第一抗原的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL。在本专利技术的一些实施例中，所述抗免疫复合物抗体及与之结合的特异性结合配对成员中的一员的总浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。本专利技术第二方面提供了一种用于检测抗-CCP抗体的均相免疫检测试剂盒，其包含如本专利技术第一方面所述的均相免疫检测试剂套装。本专利技术第三方面提供了一种如本专利技术第一方面提供的均相免疫检测试剂套装或如本专利技术第二方面提供的均相免疫检测试剂盒用于检测待测样本中抗-CCP抗体的免疫测定方法，其包括如下步骤：S1，将第一抗原与待测样本中的抗-CCP抗体结合，形成由第一抗原-抗-CCP抗体构成的第一免疫复合物；S2，将抗免疫复合物抗体与所述第一免疫复合物结合，形成由第一抗原-抗-CCP抗体-抗免疫复合物抗体所构成的第二免疫复合物；S3，检测第二免疫复合物是否存在；如果第二免疫复合物存在，则表明待测样本中存在抗-CCP抗体。在本专利技术的一些实施例中，步骤S3中通过化学发光的方法检测第二免疫复合物是否存在。根据本专利技术的一些实施方式，在上述免疫测定方法中，所述第一免疫复合物通过第一抗原与供体结合，相应的所述第二免疫复合物通过抗免疫复合物抗体与受体结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号，所述供体能够在激发状态产生单线态氧。在本专利技术的一些具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：T1，将与生物素结合的第一抗原同待检样本中的抗-CCP抗体结合，形成由生物素-第一抗原-抗-CCP抗体构成的第三免疫复合物；T2，将与受体结合的特异性识别第三免疫复合物中的抗-CCP抗体的抗免疫复合物抗体同第三免疫复合物结合，形成由生物素-第一抗原-抗-CCP抗体-抗免疫复合物抗体-受体构成的第四免疫复合物；T3，将与链霉亲和素结合的供体同第四免疫复合物结合，形成由供体-链霉亲和素-生物素-第一抗原-抗-CCP抗体-抗免疫复合物抗体-受体构成的第五免疫复合物；T4，检测第五免疫复合物是否存在；如果第五免疫复合物存在，则待测样本中存在抗-CCP抗体。在本专利技术的一些实施例中，当第五免疫复合物存在时，用能量或者活性化合物激发供体产生单线态氧，所述受体与单线态氧反应生成可检测的化学发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测抗‑CCP抗体的均相免疫检测试剂套装，其包括：组分a，其包含能够与抗‑CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合的第一抗原；组分b，其包含抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗‑CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗‑CCP抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测抗-CCP抗体的均相免疫检测试剂套装，其包括：组分a，其包含能够与抗-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合的第一抗原；组分b，其包含抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。2.根据权利要求1所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗原或所述抗免疫复合物抗体与受体相结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。3.根据权利要求2所述的试剂套装，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述试剂套装还包含组分c，其包含能够在激发状态产生单线态氧的供体；优选所述供体与特异性结合配对成员中的一员结合，而特异性结合配对成员中的另一员与所述第一抗原或所述抗免疫复合物抗体结合；进一步优选地，所述供体与链霉亲和素结合，相应地第一抗原或所述抗免疫复合物抗体与生物素结合。5.根据权利要求4所述的试剂套装，其特征在于，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体通过识别表位与第一免疫复合物中的抗-CCP抗体结合，所述识别表位是构象表位和/或线性表位。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的恒定区部分。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体不识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的轻链部分。9.根据权利要求1-8中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体特异性识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的Fc段。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体；优选地，所述抗免疫复合物抗体为单克隆抗体。11.根据权利要求10所述的试剂套装，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法包括：用人免疫复合物对动物进行免疫，获取含有所述多克隆抗体的动物血清；所述动物血清经亲和层析纯化得到特异性识别人免疫复合物的多克隆抗体。12.根据权利要求10所述的试剂套装，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法包括：将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行培养，对细胞培养上清液进行检测，保留阳性细胞株。13.根据权利要求1-12中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗原选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。14.根据权利要求13所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗原选自合成的含环瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。15.根据权利要求14所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗原为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述含瓜氨酸的肽段选自SEQIDNo.1-4。16.根据权利要求14或15所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗原通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。17.根据权利要求16所述的试剂套装，其特征在于，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。18.根据权利要求16所述的试剂套装，其特征在于，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。19.根据权利要求1-18中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述受体及与之结合的第一抗原的总浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL；和/或，所述抗免疫复合物抗体及与之结合的特异性结合配对成员中的一员的总浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。20.一种用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶星，廖智星，刘宇卉，李临，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：北京科美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11