黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了黄曲霉菌毒素‑环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用。它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线上包被环匹阿尼酸‑卵清蛋白偶联物；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。其可用于黄曲霉菌毒素‑环匹阿尼酸的检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。

Time-resolved fluorescence kit for aflatoxin-cyclopianic acid immunochromatography and its application

【技术实现步骤摘要】
黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用
本专利技术涉及黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用。
技术介绍
环匹阿尼酸首先在圆弧青霉菌中发现并分离，主要由青霉菌属和曲霉菌属真菌产生一种次级代谢产物。环匹阿尼酸性质稳定，一般的储存条件和加工过程不能破坏，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。环匹阿尼酸可污染花生、玉米、饲料等多种农产品，人和动物摄入后，会引起心肌细胞变性、重量减轻和共济失调等症状，对人们的饮食安全造成重大威胁。目前，现有环匹阿尼酸检测方法包括薄层层析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。其中薄层层析法不需要特殊的仪器设备，但试剂用量大、操作繁琐、不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大。高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等精密仪器分析法灵敏度高，准确性好，但又有仪器昂贵，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测。免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、对环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用。该免疫层析时间分辨荧光试剂盒可用于黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线上包被环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生，所述的杂交瘤细胞株YTT-2于2018年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201871。按上述方案，所述铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将抗环匹阿尼酸单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗环匹阿尼酸单克隆抗体：40μg～90μg。按上述方案，所述的活化方法为取铕标记试剂，用pH8.20.2M的硼酸缓冲液超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清，用pH8.20.2M的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15～30min。上述配制好的铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体复溶于含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白的0.01mol/LpH7.4的磷酸缓冲液中备用，使用时，取一定量的铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体放入样品反应瓶中，置于冷冻干燥机中冻干，得到铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品，备用。按上述方案，所述荧光试纸条中的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm；检测垫长18～30mm，宽3～4mm；样品垫长10～12mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物CPA-OVA的包被量为100～400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的含量为100～200ng。按上述方案，所述黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01～0.30％的吐温-20水溶液。按上述方案，所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；(2)检测垫的制备：将环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物CPA-OVA用包被缓冲液配制成浓度为0.2～0.5mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15～20mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.2～0.5mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；(3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)荧光试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得荧光试纸条。按上述方案，所述荧光试纸条的制备中配制环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物CPA-OVA包被液中所使用的包被缓冲液为：1g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述的兔抗鼠多克隆抗体的包被液中所使用的包被缓冲液为:0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：将2g卵清蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，0.5g吐温-20，加水定容至100mL所得。上述黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸免疫层析时间分辨荧光试剂盒在环匹阿尼酸含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应6～10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光免疫层析试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于荧光免疫层析试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值与环匹阿尼酸浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中环匹阿尼酸的含量，最后经换算即得待测样品中环匹阿尼酸的含量。按上述方案，所述的前处理为将样品经甲醇提取，具体为：将待测样品磨细，加入体积浓度为70％的甲醇/2％NaHCO3水溶液，振荡提取，离心取上清，用正己烷萃取后收集下层水相，加入10％氯化钾溶液，并用HCl调节至pH2-3，用氯仿振荡提取，收集下层氯仿层，旋转蒸发浓缩去除氯仿，将沉淀用甲醇溶解，获得甲醇提取液即待测样品溶液。按上述方案，所述的荧光试纸条检测线荧光强度(T)与质控线荧光强度(C)的比值(T/C)与环匹阿尼酸浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：(1)配制得到一系列浓度的环匹阿尼酸标准品溶液；(2)将适量上述各浓度的环匹阿尼酸标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.黄曲霉菌毒素‑环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线上包被环匹阿尼酸‑卵清蛋白偶联物；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。

【技术特征摘要】
1.黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：它包括荧光试纸条和含有铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线上包被环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。2.根据权利要求1所述的黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将抗环匹阿尼酸单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂偶联抗环匹阿尼酸单克隆抗体：40μg～90μg。3.根据权利要求2所述的黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的活化方法为取铕标记试剂，用pH8.20.2M的硼酸缓冲液超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清，用pH8.20.2M的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15～30min。4.根据权利要求1所述的黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm；检测垫长18～30mm，宽3～4mm；样品垫长10～12mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。5.根据权利要求1所述的黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物CPA-OVA的包被量为100～400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的含量为100～200ng。6.根据权利要求1所述的黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：其还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01～0.30％的吐温-20水溶液。7.根据权利要求1所述的黄曲霉菌毒素-环匹阿尼酸的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；(2)检测垫的制备：将环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，李慧，唐晓倩，张兆威，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42