一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法技术

本发明专利技术涉及一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS‑免疫层析检测方法，其检测原理是以硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membranes，NC)为载体，双层染料5，5′‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸){5，5′‑dithiobis‑(2‑nitrobenzoic acid)，DTNB}标记Au@Ag纳米材料偶联检测抗体作为SERS探针，结合传统的免疫层析法(Immunochromatographic assay，ICA)建立新型的基于表面增强拉曼光谱的免疫层析技术(SERS‑ICA)，应用该技术检测了人IgM和肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)特异性IgM阳性血清标本。检测分为样品稀释、SERS探针的释放，抗原抗体反应、结果分析等过程。通过本发明专利技术可提高人IgM的检测灵敏度和肺支阳性血清标本的检出率，对于临床治疗具有重要的意义。

A SERS-Immunochromatographic Method for Rapid and High Sensitivity Detection of Mycoplasma Pneumoniae Infection

【技术实现步骤摘要】
一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法
本专利技术涉及体外诊断试剂
，具体涉及一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法。
技术介绍
肺炎支原体是一个缺乏肽聚糖细胞壁的病原体，不需要宿主细胞，可以自主复制；流行于全世界范围内的各个年龄段，是肺炎和呼吸道疾病的主要病因。将近6％-30％的成人和20％-40％的儿童由于感染肺炎支原体而罹患社区获得性肺炎，并且每3-7年有一次流行高峰肺支的早期诊断对于决定治疗方法和引导合适的抗体治疗至关重要。现有的金标准方法依然是传统的细胞培养作为肺支最可靠和廉价的诊断方法。然而，肺支培养耗时，需要2-8周，并且需要特殊的培养皿和专业的技术人员。另外一个传统的方法是血清学分析方法，由于其灵敏度比较低，对于肺支感染的诊断是不准确的。为了代替传统的检测方法，基于抗原和核酸检测的分子生物学方法成为了鉴定肺支的主要方法，包括聚合酶连反应(PCR)、DNA测序和酶联免疫试验(ELISA)。这些分子生物学技术在肺支检测中达到了高灵敏度和高度选择性的目的，但是仍然存在一些缺点，例如需要尖端设备和昂贵试剂，冗长和复杂的步骤，还有偶尔的假阳性结果。表面增强拉曼散射(Surface-EnhancedRamanScattering，SERS)技术，其表面增强效应可以将拉曼信号放大1014～1015倍，这种极高的检测灵敏度决定了SERS良好的应用前景。胶体金免疫层析(Immunochromatography，IC)技术操作简单快速、分析结果清楚、易于判断，在食品质量检测、环境监测和医学等领域已得到了广泛的应用。将SERS检测技术与免疫层析检测技术结合起来，同时利用了免疫层析简单、快速、易操作的优点和SERS灵敏度高、特异性强的优点，并运用此方法实现对人血清中肺支感染的诊断。本专利技术操作简单，节约时间，灵敏度高，特异性强；为肺炎支原体感染的早期诊断提供快速，简便，高灵敏的检测方法。
技术实现思路
本专利技术针对传统胶体金免疫层析技术检测灵敏度低的问题，公开了SERS-免疫层析试纸条的制备方法，以及检测人IgM的方法和检测肺炎支原体IgM抗体阳性血清临床实际标本的实验方法。目的是提高SERS-免疫层析的检测灵敏度和肺支阳性血清标本的检出率。为了达到上述目的，本专利技术包含以下检测步骤：1、双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备，包括：Au@Ag纳米材料、拉曼分子、检测抗体；2、用划膜仪将抗体或者抗原固定到硝酸纤维素膜的控制线(C线)和检测线(T线)；3、SERS-免疫层析试纸条的制备：先将拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)喷涂到结合垫上，再将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在聚乙烯PVC底板上，切割成6×0.35cm规格后，成为一根SERS-免疫层析试纸条；4、样品液的层析：在SERS-免疫层析试纸条的样品垫上滴加包含检测物的样品液，检测物与SERS探针形成免疫复合物，并被T线上的抗原或者抗体捕获；5、检测结果读取：使用拉曼光谱仪检测试纸条T线区域的SERS信号，并根据检测信号判读结果。步骤1所述的Au@Ag纳米材料是通过AuNPs表面原位生长Ag壳合成Au@Ag核壳纳米材料，所述的拉曼分子是5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸){5，5′-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid)，DTNB}。步骤1所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料的合成和制备包括下列步骤：在100mL沸腾的0.01wt％的氯金酸溶液中加入1.5mL1wt％的柠檬酸钠溶液，制备出35nm左右的AuNPs。DTNB加入到AuNPs溶液里至终浓度10μM，8000rpm离心8分钟除去多余的DTNB。0.5mL柠檬酸钠(1％，w/v)加入到50mLAu/DTNBNPs溶液中搅拌加热，1mL的硝酸银(1mM)逐滴加入，搅拌并且煮沸15分钟。步骤1所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备包括下列步骤：500μLAu/DTNB@Ag/DTNBNPs溶液与20μL新鲜配制的EDC/sulfo-NHS溶液(1mg/mL)混合，混合液震荡15分钟。5μL抗体(5mg/mL)和500μLBBS缓冲液(10mM，pH8.0)加入到上述溶液中，混合物室温震荡2小时以偶联抗体。步骤1所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备中，偶联羊抗人IgM的SERS探针用于检测人IgM；偶联鼠抗人IgM(μ链)的SERS探针用于检测人血清中的肺支特异性IgM抗体。步骤1所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)保存在含有1％BSA(w/v)，0.1％PVP(w/v)，0.5％Tween-20(v/v)和10％蔗糖(w/v)的50mMTris-HCl(pH8.0)复融液中。步骤2所述的硝酸纤维素膜的C线和T线分别固定驴抗羊IgG和羊抗人IgM，用于检测人IgM；硝酸纤维素膜的C线和T线分别固定羊抗鼠IgG和MPP1抗原，用于检测人血清中的肺支特异性IgM抗体。步骤4中的样品稀释液1×PBST用于稀释人IgM，2％氯化钠溶液用于稀释临床血清标本。步骤5中所用样品液体积为70μL。步骤6中所述的信号采集，其功率10毫瓦，信号采集时间5秒，沿T线位置选取均匀分布的5个点进行信号采集，在拉曼检测仪器上通过软件在1335cm-1波段时读取峰值，在检测人IgM时，峰值越高表明人IgM浓度越高；在检测临床血清标本时，通过计算肺支阴性血清的拉曼峰值得到一个临界值，峰值强于临界值的血清标本为肺支阳性，低于临界值的血清标本为肺支阴性。本专利技术是首次将双层染料标记Au@Ag作为SERS探针用于检测人血清中的肺支感染，通过构建新型的SERS-免疫层析技术，将SERS免疫检测探针固定到结合垫上，样品液经过层析溶解SERS探针，样品液中的有效物质被SERS探针捕获，形成SERS探针-免疫复合物并层析至T线处，然后被T线固定的抗体或者抗原捕获。采用拉曼光谱仪检测，样品为人IgM溶液时，在1335cm-1处峰值越高说明人IgM浓度越高；样品为临床血清时，峰值强度高于临界值时为肺支阳性血清，低于临界值时为肺支阴性血清。本专利技术的灵敏度比传统的胶体金免疫层析高，检测过程简单，节约时间，可用于临床诊断。通过本专利技术可提高人IgM的检测灵敏度和肺炎支原体IgM阳性血清标本的检出率，解决传统方法可能存在的阳性漏检问题，最大限度地辅助于临床治疗。实施例1：Au/DTNB@Ag/DTNBSERS探针的表征。本实施例中AuNPs的粒径约35nm，Au@Ag的粒径约44nm，银壳厚度约4nm。实施例2：SERS-免疫层析试纸条定量检测和分析人IgM的结果。本实施例中SERS-免疫层析试纸条双抗体夹心检测人IgM的检测灵敏度为0.1ng/mL。实施例3：SERS免疫层析试纸条检测20例肺支IgM阳性血清标本的结果。本实施例中SERS-免疫层析试纸条检测肺支阳性血清标本的检出率为100％，比ELISA高了15％。实施例4：SERS-免疫层析试纸条检测肺支阳性血清标本的特异性实验结果。本实施例中检测了其他六种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS‑免疫层析检测方法特征在于，包含以下检测步骤：(1)双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料‑抗体复合物(SERS探针)的制备，包括：Au@Ag纳米材料、拉曼分子、检测抗体；(2)用划膜仪将抗体或者抗原固定到硝酸纤维素膜的控制线(C线)和检测线(T线)；(3)SERS‑免疫层析试纸条的制备：先将拉曼分子标记Au@Ag纳米材料‑抗体复合物(SERS探针)喷涂到结合垫上，再将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在聚乙烯PVC底板上，切割成6×0.35cm规格后，成为一根SERS‑免疫层析试纸条；(4)样品液的层析：在SERS‑免疫层析试纸条的样品垫上滴加包含检测物的样品液，检测物与SERS探针形成免疫复合物，并被T线上的抗原或者抗体捕获；(5)检测结果读取：使用拉曼光谱仪检测试纸条T线区域的SERS信号，并根据检测信号判读结果。

【技术特征摘要】
1.一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法特征在于，包含以下检测步骤：(1)双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备，包括：Au@Ag纳米材料、拉曼分子、检测抗体；(2)用划膜仪将抗体或者抗原固定到硝酸纤维素膜的控制线(C线)和检测线(T线)；(3)SERS-免疫层析试纸条的制备：先将拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)喷涂到结合垫上，再将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在聚乙烯PVC底板上，切割成6×0.35cm规格后，成为一根SERS-免疫层析试纸条；(4)样品液的层析：在SERS-免疫层析试纸条的样品垫上滴加包含检测物的样品液，检测物与SERS探针形成免疫复合物，并被T线上的抗原或者抗体捕获；(5)检测结果读取：使用拉曼光谱仪检测试纸条T线区域的SERS信号，并根据检测信号判读结果。2.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的Au@Ag纳米材料是通过AuNPs表面原位生长Ag壳合成Au@Ag核壳纳米材料，所述的拉曼分子是5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸){5，5′-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid)，DTNB}。3.根据权利要求1和2所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料的合成和制备包括下列步骤：在100mL沸腾的0.01wt％的氯金酸溶液中加入1.5mL1wt％的柠檬酸钠溶液，制备出35nm左右的AuNPs。DTNB加入到AuNPs溶液里至终浓度10μM，8000rpm离心8分钟除去多余的DTNB。0.5mL柠檬酸钠(1％，w/v)加入到50mLAu/DTNBNPs溶液中搅拌加热，1mL的硝酸银(1mM)逐滴加入，搅拌并且煮沸15分钟。4.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备包括下列步骤：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，贾小飞，肖瑞，汪崇文，荣振，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11