抑制畸胎瘤形成的多能干细胞衍生的神经前体细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，通过本发明专利技术的制备方法制备而成的神经前体细胞不仅提高神经前体细胞的纯度并抑制畸胎瘤的形成，而且增加细胞的存活率及回收率。

Preparation of neural precursor cells derived from pluripotent stem cells inhibiting teratoma formation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抑制畸胎瘤形成的多能干细胞衍生的神经前体细胞的制备方法
本专利技术涉及一种从多能干细胞抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法。
技术介绍
多能干细胞是一种能够在保持未分化状态的同时无限增殖并且在一定的环境和条件下可以分化成特定功能和形态的细胞。人类多能干细胞可在适当的培养条件下无限增殖(自我更新；self-renewal)，并且，可分化为构成个体的各种细胞。因此，针对理解对个体发育、分化及生长的基本知识和开发用于治疗个体损伤或疾病的治疗剂，而正在进行各方面的研究。胚胎干细胞作为多能干细胞中的一种，与细胞分裂停止的分化细胞不同，可以进行自我更新而无限地生成与自我更新细胞相同的细胞，并且，具有可通过多种环境或刺激分化为身体的所有功能细胞的分化全能性。因此，当细胞或器官受损时，可将胚胎干细胞用作其分化的特定细胞，进而，利用胚胎干细胞的疗法正成为各种难治愈性疾病的基本治疗方法。人诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)作为多能干细胞的类型之一，是指将已分化的细胞通过遗传修饰或者利用外分泌因子的重编程而进行逆分化的细胞，使细胞具有分化全能性。iPSC也可以与胚胎干细胞类似地进行自我更新，并可分化为身体的所有类型的细胞。迄今为止，诱导性多能干细胞在基因表达和分化潜能中，具有与胚胎干细胞几乎相同的特征。含有神经前体细胞而从人类多能干细胞分化的特定分化细胞利用在特定分化细胞中被表达的各个固有表面标志(surfacemarker)，可通过流式细胞分选法(fluorescenceactivatedcellsorting，FACS)或磁性激活细胞分选法(Magneticactivatedcellsorting，MACS)分离。但是，在磁性激活细胞分选法的情况下，纯度相对低且没有高回收率，并且在一些情况下，可导致根据磁性材料的变形。在流式细胞分选法的情况下，具有激光损坏细胞的缺点。并且，当分离来自多能干细胞的分化细胞时，由于磁性激活细胞分选法及流式细胞分选法都具有未分化的多能干细胞的混淆可能性，因此，仅分离具有100％纯度的分化细胞受到技术性限制。因此，在利用多能干细胞而开发的细胞治疗剂中，不能排除畸胎瘤形成的可能性。因此，开发一种从已分化的细胞群选择性去除未分化多能细胞的技术，其不影响分化细胞且导致畸胎瘤发生的风险，对于多能干细胞衍生细胞治疗剂的临床和商业化是必不可少的。并且，在对作为人类多能干细胞转录因子的Oct-4、Nanog及Sox-2等与作为细胞表面标志的TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3及SSEA4等的抗体从分化细胞群分离及去除多能干细胞时使用阴性选择(negativeselection)方法。但是，据报道，由于大多数上述因子或标志具有碳水化合物表位或者其功能对于人类多能干细胞的自我再生产或分化全能性维持不是必需的，因此，不能保证准确地和选择性地仅分离未分化多能干细胞。并且，存在通过基因操作使在特定时期的未分化细胞自然死亡的方法，但是这些基因操作方法具有其效率低并且其安全性未得到验证的缺点。
技术实现思路
技术问题为此，本专利技术人在为了在多能干细胞衍生神经前体细胞的制备中找出抑制畸胎瘤形成的方法而进行研究的过程中，确认了本专利技术的畸胎瘤抑制方法在培养过程中自然去除未分化多能干细胞且阻断畸胎瘤发生的可能性，从而完成了本专利技术。本专利技术的目的在于，提供一种抑制畸胎瘤形成的多能干细胞衍生的神经前体细胞的制备方法。解决问题的手段为了实现上述目的，本专利技术提供一种抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，包括：对神经前体细胞进行单细胞化的步骤；对上述单细胞化的神经前体细胞进行自发性再凝集的步骤；以及对上述再凝集的神经前体细胞进行回收的步骤。并且，本专利技术提供通过上述抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法制备而成的神经前体细胞。与此同时，本专利技术提供包括分化上述神经前体细胞的步骤的神经细胞的分化方法。专利技术的效果根据本专利技术的神经前体细胞的制备方法不仅提高神经前体细胞的纯度并抑制畸胎瘤的形成，而且增加细胞的存活率及回收率。附图说明图1为对本专利技术的神经前体细胞的制备方法(B)与现有方法(A)进行比较的图。图2为通过神经细胞标志的表达与否来确认神经前体细胞分化为神经细胞的分化能力的图。图3为通过免疫染色来确认在神经前体细胞中神经前体细胞标志的表达与否的图。图4为确认细胞(A)及细胞(B)的存活率的图表，上述细胞(A)为对神经前体细胞进行作为常规方法的酶处理来进行单细胞化的细胞，上述细胞(B)为切片化后进行粘附培养而酶处理的细胞。图5为示出在神经前体细胞被单细胞化后进行自发性凝集的过程中在培养皿中出现的多个凝集物的性状及大小变化的图。图6为通过流式细胞分析来确认未分化多能干细胞标志(A)及神经前体细胞标志(B)在胚胎神经前体细胞(SNM)及再凝集的神经前体细胞(Reform)中的表达的曲线图。图7为通过RT-PCR来确认未分化标志及神经前体细胞标志在再凝集的神经前体细胞中的表达与否的图。图8为通过免疫组织学染色来确认再凝集的神经前体细胞的分化能力是否维持的图。具体实施方式以下，详细说明本专利技术。本专利技术提供一种抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，包括：步骤1)，对神经前体细胞进行单细胞化；步骤2)，对在上述步骤1)的单细胞化的神经前体细胞进行再凝集；以及步骤3)，对在上述步骤2)的再凝集的神经前体细胞进行回收。本专利技术的制备方法简要示出在图1的(B)部分，以往的制备方法简要示出在图1的(A)部分。本说明书中所使用的术语“神经前体细胞”意味着从诸如人体胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的多能干细胞形成的神经前体细胞或者从神经组织分离的神经前体细胞以球的形态凝集。在上述制备方法中，可将加入N-2添加剂、bFGF或其的混合物的培养基用作细胞的培养用培养基。本说明书中所使用的术语“N-2添加剂(supplement)”作为基于Bottenstein’sN-1制剂(formulation)而化学定义的无血清补充剂，在周围神经系统与中枢神经系统的一次培养分裂之后，为了神经细胞及神经母细胞瘤的生长与表达，可一同加入到补充有bFGF及EGF等的生长因子的培养用培养基中来使用。相对于神经前体细胞培养用培养基的总体积，上述N-2添加剂的添加量为0.5％(v/v)至2.0％(v/v)，更具体地，可以为1.0％(v/v)至1.5％(v/v)。若上述N-2添加剂的添加量小于0.5％(v/v)，则细胞的生长效率可能会降低，若大于2.0％(v/v)，则过度营养的增殖可对细胞培养的维持产生影响。根据本专利技术的一实施例，相对于神经前体细胞培养用培养基的总体积，上述N-2添加剂的添加量可以为1％(v/v)。本说明书中所使用的术语“bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；basicFibroblastgrowthfactor)”意味着对正常成纤维细胞及确立的细胞株均强有力的有丝分裂刺激因子。上述bFGF可具有细胞的移动、新型血管的形成、神经细胞的维持、内分泌功能的调节、特定细胞性蛋白的表达、细胞外基质的生产及细胞生存的促进等的功能。相对于神经前体细胞培养用培养基的总质量，上述bFGF的添加量为0.0002％(w/v)至0.001％(w/v)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，包括：步骤1)，对神经前体细胞进行单细胞化；步骤2)，对在上述步骤1)的单细胞化的神经前体细胞进行再凝集；以及步骤3)，对在上述步骤2)的再凝集的神经前体细胞进行回收。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.30 KR 10-2016-01843251.一种抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，包括：步骤1)，对神经前体细胞进行单细胞化；步骤2)，对在上述步骤1)的单细胞化的神经前体细胞进行再凝集；以及步骤3)，对在上述步骤2)的再凝集的神经前体细胞进行回收。2.根据权利要求1所述的抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，上述抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法使用含有N-2添加剂、bFGF或其混合物的培养基作为细胞的培养用培养基。3.根据权利要求2所述的抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，上述N-2添加剂的添加量为0.5％(v/v)至2.0％(v/v)。4.根据权利要求2所述的抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，上述bFGF的添加量为0.0002％(w/v)至0.001％(w/v)。5.根据权利要求1所述的抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，上述步骤1)在涂敷有底物的培养皿中进行。6.根据权利要求5所述的抑制畸胎瘤形成的神经前体细胞的制备方法，其特征在于，上述底物为选自由层...

【专利技术属性】
技术研发人员：曺明洙，林美善，池素蓮，
申请(专利权)人：第一药品株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR