分化多能细胞的方法技术

在一些方面中，提供了用于使用单‑SMAD抑制或仅用一种SMAD抑制剂抑制SMAD信号转导将多能细胞分化成中脑多巴胺能(DA)神经元的方法。在一些实施方式中，单‑SMAD抑制利用骨形态发生蛋白(BMP)的单一抑制剂将多能细胞分化成中脑DA神经元。

Differentiation of pluripotent cells

In some respects, methods are provided for the differentiation of pluripotent cells into mesencephalic dopaminergic (DA) neurons using single SMAD inhibitor or only one SMAD inhibitor to inhibit SMAD signal transduction. In some embodiments, single SMAD inhibits the differentiation of pluripotent cells into midbrain DA neurons using a single inhibitor of bone morphogenetic protein (BMP).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分化多能细胞的方法
技术介绍
本申请要求2016年08月16日提交的美国临时专利申请62/375,590的权益，其全部内容通过引用纳入本文。1.专利
本专利技术一般涉及分子生物学和医学领域。更具体地，其涉及由多能细胞生成多巴胺能神经元的方法。2.
技术介绍
保留分化成多种具体细胞类型能力的细胞群能够用于产生大量谱系特异性分化的细胞群。考虑将这些谱系特异性分化的细胞群用于针对患有导致限定细胞群功能丧失的疾病的患者的细胞替代疗法。除了其直接的治疗性价值，谱系特异性分化的细胞还是用于各种目的的有价值研究工具，包括体外筛选试验以鉴定、确认和测试具体功能或用于测试递送治疗性分子以治疗细胞谱系特异性疾病。例如，在帕金森病的情况中，中脑多巴胺能(DA)神经元的损失导致出现疾病症状。因此，需要由多能细胞产生DA神经元细胞的方法，因为这类细胞可以治疗性地使用并用于疾病模型，例如，以鉴定用于帕金森病治疗的新型治疗。已经尝试了各种方法由多能细胞生成中脑DA神经元。例如，由多能细胞生成中脑DA神经元的方法通常需要使用DN-193189，其是BMP信号转导的抑制剂(抑制ALK1/2/3/6，阻断SMAD1/5/8)和SB-431542，其是TGF-β信号转导的抑制剂(抑制ALK4/5/7，阻断SMAD2/3)，如在WO2013/067362中所述。因为这些方法利用小母抗Dpp(SmallMothersAgainstDecapetaplegic，SMAD)信号转导的2个抑制剂的组合，所述这些方法通常被称为“双SMAD抑制”或“双SMADi”。虽然可能需要专利技术仅使用单一SMAD抑制剂由诱导型多能干(iPS)细胞生成中脑多巴胺能(mDA)神经元的方法，但是迄今为止这些努力都是失败的。显然，存在对使用单一SMAD抑制剂由iPS细胞生成mDA神经元的方法的需求。
技术实现思路
在一些方面中，本专利技术通过提供这样的方法克服了现有技术的限制，所述方法使用单-SMAD抑制(单-SMADi)由多能细胞生成神经元。单-SMADi方法的使用可以提供相对于需要使用2个或多个SMAD抑制剂的SMAD信号转导抑制的方法的优势。如下述实施例中所述，提供了由多能细胞，如人诱导的多能细胞(iPS细胞)生成神经细胞系，如多巴胺能神经元。如所示，这些方法可以包括数个方面，其包括：(i)交错安排(stagger)Wnt激动剂(例如，CHIR99021)的添加至第2天或第3天，(ii)将CHIR浓度再优化(例如，使用约0.5-3.0μM，0.7-3μM，1-2.5μM，1.25-2.25μM，大于约1.25μM至约2μM，或约1.55，1.65，1.75μM，或从中衍生的任何范围)，和/或(iii)在第3-5天将MEK抑制剂(例如，PD0325901)包含在分化培养基中。该方法可以包括例如，上述方面(i和ii)、(ii和iii)，(i和iii)或(i，ii和iii)。在一些实施方式中，将细胞暴露于BMP抑制剂(例如，背吗啡(dorsomorphin)或LDN-193189)，而将细胞不暴露于TGF-β抑制剂如SB431542，以促进细胞分化成中脑DA神经元或FOXA2+/LMX1A+细胞。如小鼠实施例所示，这些方法可以用于以仅含单一SMAD抑制剂(例如，仅有背吗啡或仅有LDN-193189)的培养基由iPS细胞系的高效mDA祖细胞形成。本专利技术的方面涉及用于制备包含这样人细胞的细胞组合物的体外方法，所述人细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)(FOXA2+/LMX1+细胞)，所述方法包括在下述信号转导调节剂存在的情况下培养人多能细胞：(a)小母抗Dpp(SmallMothersAgainstDecapentaplegic，SMAD)信号转导的单一抑制剂，(b)音猬因子(Sonichedgehog)(SHH)信号转导的至少一种激活剂，和(c)无翼(wingless)(Wnt)信号转导的至少一种激活剂；并在存在所述调节剂的情况下培养所述细胞一段时间以提供包含所述FOXA2+/LMX1+细胞的细胞组合物。在一些优选的实施方式中，LMX1是LIM同源框转录因子1α(LMX1A)。在一些实施方式中，SMAD信号转导的抑制剂是BMP抑制剂，诸如LDN-193189(例如，以约0.2μM至约4μM的浓度，或更优选地大于0.2μM至4μM，约1μM，2μM，3μM，4μM，从中衍生的任何范围)背吗啡，DMH-1或头蛋白。如下实施例中所示，增加LDN-193189的浓度(例如，2μM，相较于0.2μM)导致iPS细胞到FOXA2+/LMX1+细胞或背吗啡神经元的分化改善。在一些实施方式中，BMP抑制剂是LDN-193189。SMAD信号转导抑制剂可以是TGFβ抑制剂(TGFβ信号转导途径抑制剂)，诸如SB431542(例如，SB431542以约5-100、20-60、30-50μM或约40μM的浓度存在)。在一些实施方式中，在第1-15、1-16或1-17天培养时用SMAD的抑制剂培养多能细胞。基本上连续地或每天用SMAD的抑制剂培养多能细胞15、16或17天。SMAD的抑制剂可以约50-2000、50-500、500-2500或500-2000nM，或约180-240nM的浓度存在。在一些实施方式中，该方法还包括用MEK抑制剂接触多能细胞。MEK抑制剂可以是PD0325901。在一些实施方式中，PD0325901以约0.25-2.5μM或约0.5-1.5μM的浓度存在。在一些实施方式中，与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，MEK抑制剂与多能细胞接触约1-3天，或在与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后第1-3、2-4、3-5天或第1、2、3、4或5天接触(例如，可从分化第2天或第3天开始持续约72小时完成接触)。与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，MEK抑制剂可以与多能细胞接触约48至约72小时，24-96小时或24-48小时。在一些实施方式中，与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后约1-2天开始将MEK抑制剂与多能细胞每天或基本连续地接触约3-4天。在一些实施方式中，在第1天开始与SMAD信号转导的抑制剂的接触后第2-5天、第3-6天或第3-5天，MEK抑制剂与多能细胞接触。Wnt信号转导的激活剂可以是GSK3抑制剂，诸如CHIR99021。CHIR99021可以约0.5-3μM的浓度或以大于约1.25μM至约2μM的浓度存在(例如，约1.5-2.0μM，约1.55-1.75μM或约1.55、1.65、1.75μM或其中可衍生的任何范围；并且在一些实施方式中，在第1天与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后第9-17天或11-17天，可以使用较高的浓度，例如，4-7μM或6μM)。在一些实施方式中，与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，Wnt信号转导的激活剂与多能细胞接触1-3天。与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，Wnt信号转导的激活剂可与多能细胞接触12-48小时或24-48小时。基本上连续地或每天用Wnt信号转导的激活剂培养多能细胞10、11、12、13、14、15或约16天。在第1天与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后第2-17天，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备包含人细胞的细胞组合物的体外方法，所述人细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)(FOXA2

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.16 US 62/375,5901.一种用于制备包含人细胞的细胞组合物的体外方法，所述人细胞表达叉头框蛋白A2(FOXA2)和LIM同源框转录因子1(LMX1)(FOXA2+/LMX1+细胞)，所述方法包括在下述信号转导调节剂存在的情况下培养人多能细胞：(a)小母抗Dpp(SMAD)信号转导的单一抑制剂，(b)音猬因子(SHH)信号转导的至少一种激活剂，和(c)无翼(Wnt)信号转导的至少一种激活剂；并在存在所述调节剂的情况下培养所述细胞一段时间，该段时间足以提供包含所述FOXA2+/LMX1+细胞的细胞组合物。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述SMAD信号转导的抑制剂是BMP抑制剂。3.如权利要求2所述的方法，其中，所述BMP抑制剂是LDN-193189，背吗啡，DMH-1或头蛋白。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述BMP抑制剂是LDN-193189。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述LDN-193189以约0.2μM至约4μM的浓度存在。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述LDN-193189以约1μM至约3μM的浓度存在。7.如权利要求1所述的方法，其中所述SMAD信号转导抑制剂是TGFβ抑制剂。8.如权利要求7所述的方法，其中所述TGFβ抑制剂是SB431542。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，在培养第1-15、1-16或1-17天用所述SMAD的抑制剂培养多能细胞。10.如权利要求9所述的方法，其中，在培养第1-17天培养用所述SMAD的抑制剂培养多能细胞。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，基本上连续地或每天用所述SMAD的抑制剂培养多能细胞15、16或17天。12.如权利要求11所述的方法，其中，基本上连续地或每天用所述SMAD的抑制剂培养多能细胞17天。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述SMAD的抑制剂以约50-2000或50-500nM的浓度存在。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述SMAD的抑制剂以约180-240nM的浓度存在。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所述多能细胞与MEK抑制剂接触。16.如权利要求15所述的方法，其中，所述MEK抑制剂是PD0325901。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述PD0325901以约0.25-2.5μM的浓度存在。18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触约1-3天，或在与所述SMAD信号转导的抑制剂接触开始后第1-3、2-4、3-5天或第1、2、3、4或5天接触。19.如权利要求18所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触约24至约48小时。20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后约1-2天开始将所述MEK抑制剂与所述多能细胞每天或基本连续地接触约3-4天。21.如权利要求20所述的方法，其中，在第1天与所述SMAD信号转导的抑制剂接触开始后第2-5天或第3-6天，所述MEK抑制剂与所述多能细胞接触。22.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述Wnt信号转导的激活剂是GSK3抑制剂。23.如权利要求22所述的方法，其中，所述GSK3抑制剂是CHIR99021。24.如权利要求23所述的方法，其中，所述CHIR99021以约0.5-3μM的浓度存在。25.如权利要求24所述的方法，其中，所述CHIR99021以大于约1.25μM至约2μM的浓度存在。26.如权利要求23所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后第9-17天，所述CHIR99021以约4-7μM的浓度存在。27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后，所述Wnt信号转导的激活剂与所述多能细胞接触1-3天。28.如权利要求27所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后24-48小时内，所述Wnt信号转导的激活剂与多能细胞接触。29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，基本上连续地或每天用所述Wnt信号转导的激活剂培养所述多能细胞14、15或约16天。30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后第2-17天，所述Wnt信号转导的激活剂与所述多能细胞接触。31.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，所述SHH信号转导的激活剂是嘌吗啡胺或C25IIShh。32.如权利要求31所述的方法，其中，所述方法还包括将所述多能细胞与SHH信号转导的两种激活剂接触。33.如权利要求32所述的方法，其中，所述SHH信号转导的两种激活剂是嘌吗啡胺和C25IIShh。34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，与所述SMAD信号转导的抑制剂开始接触的同一天或与所述SMAD信号转导的抑制剂的接触开始后的24-48小时内，所述SHH信号转导的至少一种激活剂与多能细胞接触。35.如权利要求34所述的方法，其中，与SMAD信号转导的抑制剂的接触开始之时起或开始之后的第1-7天，SHH信号转导的至少一种激活剂与多能细胞接触。36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所述多能细胞与FGF-...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·W·麦克马洪，L·E·利特尔，W·B·王，N·A·埃利奥特，
申请(专利权)人：富士胶片细胞动力股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US