用于确定候选药物的功效特征的方法技术

本申请涉及使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中基于对分化的NC进行的解离和再接种步骤，分化的NC培养物胜任高通量筛选。该方法包括将人和/或非人灵长类神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，随后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC，产生适于高通量药物筛选测定法、尤其适于筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。

A method for determining the characteristics of the efficacy of a candidate drug

The application involves the use of standardized cell cultures from the homogeneous distributed neural cells (NC) from at least two primate species to determine the efficacy of the candidate drugs in vitro, based on the dissociation and re inoculation steps for differentiated NC, and the differentiated NC cultured nutrients are competent for high throughput screening. The method includes the differentiation of human and / or non human primate precursor cells (NPC) into neuron cells (NC), then dissociates the differentiated NC from its support and inoculates the differentiated NC in high throughput cell culture mode, producing a robust culture suitable for high throughput screening assay and especially suitable for screening antisense oligonucleotides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定候选药物的功效特征的方法专利
本专利申请涉及一种使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中基于对分化的NC进行的解离和再接种步骤，分化的NC培养物胜任高通量筛选。该方法包括将人和/或非人灵长类神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，随后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC，产生适于高通量药物筛选测定法、尤其适于筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。专利技术背景在开发早期，广泛使用基于展示多种疾病(包括中枢神经系统(CNS)疾病)的病理生理学的多样细胞类型或细胞培养模型的高通量筛选测定法评估候选药物的功效特征和毒性特征。过去十年间已经通过建立从体细胞产生多潜能细胞的方案克服了有限类型细胞的局限或衍生自胚胎干细胞的细胞的局限。因为Yamanaka和同事们(Takahashi,K.和Yamanaka,S.Cell.2006；126:663–676)显示可以将体细胞再编程为诱导的多潜能干细胞(IPSC)，故而从多种细胞来源产生多潜能细胞变得可能。已经将不同类型的体细胞(包括成纤维细胞、角质形成细胞、脂肪细胞和血细胞)再编程为IPSC多潜能状态。最近，特定体细胞类型可以转分化成完全不同的体细胞类型如神经元。Vierbuchen和同事们展示了通过转导三个关键基因：Mash1、Brn2和Myt1l，使小鼠成纤维细胞直接转化成功能性神经元(Vierbuchen等人,Nature.2010；463:1035-41)。值得注意地，US2010/0021437公开一种从成纤维细胞产生诱导的多潜能干细胞并诱导这些细胞分化成NPC的方法。最近已经描述将分化的体细胞直接转化成NPC(WO2012/022725)。认为这类神经元细胞是用于各种CNS疾病的病理生理学建模的有用工具。NPC是多潜能干细胞并在特定条件下扩增。它们可以生长为单层贴壁培养物或在非贴壁细胞培养平板中生长为悬浮的神经球。两个类型的NPC培养物(神经球、贴壁培养物)似乎完全相互可转化。NPC可以无限培育并仍真实保持多潜能。一旦具备特定条件，它们分化为构成成体脑的神经元细胞类型，包括分化的NC。分化的NC培养物是筛选有效和安全药物的有用疾病模型。实际上，NC培养物对药物开发环境下评估候选药物的毒性和功效重要。在人类患者中首次施用之前，需要在体外细胞培养系统中全面评估候选药物，随后在啮齿类和非人灵长类(NHP)物种中体内测试。如今，针对不同物种使用不同方案，以不同测定模式进行新候选药物的毒性和功效评估。尽管体外测试候选药物允许减少为药物测试所处死的实验室动物的数目，但它还带来结果从体外至体内和至人生理的可转化性的难题。实际上，候选药物功效特征和毒性特征从啮齿类物种到人的可转化性可以有挑战性，原因在于物种之间遗传关系不密切。值得注意地，小鼠和人类基因组的蛋白质编码区约85％同一。遗传组成的差异可以解释对药物的不同生理反应并且还解释对毒素或诱变剂的不同耐受性。迄今，对于靶向特定DNA或RNA序列的新药物类别，例如反义寡核苷酸或者基因或基因产物的基因变体，物种之间的可转化性甚至变得更重要。因此，就密切的遗传相关性(>90％)而言，NHP物种代表了产生功效和毒性数据以预测人类中反应和不良事件率的最有意义的模型系统。在不受理论约束的情况下，假定在全部药物类别的人体首次试验之前，NHP物种(例如食蟹猴)中的体内试验是优选的，不过尤其对靶向确定的人类遗传组成的药物类别是这样。在另一方面，药物研发中使用NHP物种仍是争议话题。NHP物种遗传上接近于人类的确切事实提出了伦理学问题。因此，应当尽可能降低NHP实验室动物(例如食蟹猴)的数目。筛选新候选药物功效和毒性的全面计划因此应当包括在NHP物种上的体外和体内试验和使用IPSC衍生的人细胞的平行体外试验。测试顺序应当包括在NHP物种和人细胞上的平行体外试验，其先于NHP物种(例如食蟹猴中)的体内试验。功效和/或毒性特征低劣的候选药物应当已经在NHP物种中启动体内试验之前，在NHP和/或人细胞上体外评估时在早期阶段落选。实际上，这个顺序确保NHP实验室动物的数目可以尽可能低。但是，存在从干细胞衍生的分化的NC体外获得这类灵长类物种间可转移性功效和毒性数据的强大障碍：首先，物种特异的细胞培养方案并且灵长类物种之间细胞培养条件的不可转移性，并且其次，正在分化的NPC非均匀性分布导致存活条件非最佳或分化作用受阻，原因在于细胞和自分泌及旁分泌信号传导局部浓集，这导致药物效应的表型评估难题。当培养物不得不长时间分化以获得所需的细胞分化状态时，这变得最明显。最值得注意地，分化的灵长类NC是对细胞培养条件天生敏感并且不耐受用这些细胞产生标准化测定法时作为内在障碍的苛刻处理。因此，仍需要从不同灵长类物种(包括人)产生均匀NC测定法用于高通量筛选候选药物的容易获得和可重复的技术。专利技术概述本文中提供一种使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；b)在分化培养基中温育再接种的NC；c)使再接种的NC与候选药物接触；和d)确定候选药物的体外功效特征。在一个实施方案中，灵长类物种选自人(Homosapiens)、食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)。在一个实施方案中，灵长类物种之一是人(Homosapiens)。在一个实施方案中，灵长类物种之一是食蟹猴。在一个实施方案中，分化的NC衍生自诱导的多潜能干细胞(iPSC)。在一个实施方案中，如通过细胞核染色所评估，分化的NC遍及细胞培养区域均匀分布。在一个实施方案中，通过DNA染色，尤其通过Hoechst染色评估分化的NC的分布。在一个实施方案中，步骤d)额外地包括监测细胞培养物的毒性迹象。在一个实施方案中，步骤d)包括监测细胞培养物的表型改变，所述细胞培养物的表型改变指示候选药物的功效。在一个实施方案中，确定的候选药物体外功效特征用于候选药物功效特征的物种间比较，其中从至少两种灵长类物种的细胞单独产生细胞培养物，其中基本上相同的条件应用于全部灵长类物种的培养物并且其中针对全部灵长类物种确定和比较功效特征。在一个实施方案中，提供用于选择候选药物用于进一步开发的方法，所述方法包括步骤：(i)根据如本文所述的方法，确定候选药物对第一和第二物种的体外功效特征；并且(ii)如果候选药物的功效特征有利，则选择候选药物用于进一步开发。在一个实施方案中，第一和第二物种之间的遗传相似性高，尤其超过90％。在一个实施方案中，第一物种是食蟹猴(Macacafascicularis)并且第二物种是人(Homosapiens)。在一个实施方案中，候选药物包含核酸分子或靶向特定核酸序列。在一个实施方案中，候选药物包含至少一种核酸分子如RNAi剂或反义寡核苷酸。在一个实施方案中，进一步开发包括确定候选药物的体内功效和/或毒性特征。在一个实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中所述分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；b)在分化培养基中温育再接种的NC；c)使再接种的NC与候选药物接触；和d)确定候选药物的体外功效特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.12 EP 15194367.7;2016.09.19 EP 16189502.41.使用来自至少两种灵长类物种的均一分布的分化的神经细胞(NC)的标准化细胞培养物，确定候选药物体外功效特征的方法，其中所述分化的NC培养物胜任高通量筛选，所述方法包括步骤：a)在约20天至约45天分化后将分化的NC从其支持物解离并以高通量细胞培养模式再接种分化的NC；b)在分化培养基中温育再接种的NC；c)使再接种的NC与候选药物接触；和d)确定候选药物的体外功效特征。2.根据权利要求1所述的方法，其中灵长类物种选自人(Homosapiens)、食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中分化的NC衍生自诱导的多潜能干细胞(iPSC)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中如通过细胞核染色所评估，分化的NC遍及细胞培养区域均匀分布。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤d)额外地包括监测细胞培养物的毒性迹象。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤d)包括监测细胞培养物的表型改变，所述细胞培养物的表型改变指示候选药物的功效。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·克苏林，V·科斯塔，M·赫纳，C·帕奇，E·C·托马，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH