来自灵长类物种的标准化神经元细胞测定试验制造技术

本申请涉及一种从灵长类物种产生标准化且稳健的神经元细胞培养物测定试验的方法，例如适用于药物候选物的高通量筛选的试验。该方法包括将人和/或非人灵长类神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，基于在分化的NC上进行的解离和再接种步骤产生均一的NC培养物，导致适用于高通量药物筛选测定试验，特别是筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。

Standardized neuron cell assay for primate species

This application involves a method of testing a standardized and robust neuron cell culture from primate species, such as a high throughput screening test for drug candidates. This method includes the differentiation of human and / or non human primate neuron precursor cells (NPC) into neuron cells (NC), and produces a homogeneous NC culture based on the dissociation and re inoculation steps on the differentiated NC, which is suitable for high throughput drug screening test, especially the robust culture of antisense oligonucleotides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自灵长类物种的标准化神经元细胞测定试验
本申请涉及一种从灵长类物种产生标准化且稳健的神经元细胞培养物测定试验的方法，例如适用于高通量筛选药物候选物的测定试验。该方法包括，将人和/或非人灵长类动物神经元前体细胞(NPC)分化成神经元细胞(NC)，和基于在分化的NC上进行的解离(dissociate)和再接种(reseed)步骤，产生均一的NC培养物，从而获得适用于高通量药物筛选测定，特别是筛选反义寡核苷酸的稳健培养物。
技术介绍
基于显示各种疾病(包括中枢神经系统(CNS)疾病)的病理生理学的各种细胞类型或细胞培养物模型的高通量筛选试验，广泛用于早期评估药物候选物的功效和毒性特征。在过去的十年中，通过建立从体细胞产生多能细胞的方案，克服了由有限的细胞类型或细胞的胚胎干细胞来源所造成的局限性。自从Yamanaka及其同事(Takahashi，K。&Yamanaka，S.Cell.2006；126：663-676)证明了体细胞可重编程为诱导的多能干细胞(IPSCs)，已经可以从多种细胞来源产生多能细胞。已经将不同类型的体细胞，包括成纤维细胞，角质形成细胞，脂肪细胞和血细胞，重编程为IPSC多能状态。最近，特定的体细胞类型可以被转分化成完全不同的体细胞类型，例如神经元。Vierbuchen及其同事证明，通过转导三种关键基因Mash1，Brn2和Myt11，小鼠成纤维细胞可以直接转化为功能性神经元(Vierbuchen等，Nature。2010；463：1035-41)。值得注意的是，US2010/0021437公开了从成纤维细胞产生诱导的多能干细胞并诱导这些细胞分化成NPC的方法。最近已经描述了分化的体细胞向NPC的直接转化(WO2012/022725)。这些神经元细胞被认为是模建各种CNS疾病的病理生理学的有价值的工具。NPC是多能干细胞并在特定条件下繁殖。它们可以生长为单层贴壁培养物，也可以在非贴壁细胞培养板中生长为漂浮神经球(neurosphere)。两种类型的NPC培养物(神经球，贴壁培养物)似乎是完全可以相互转化的。NPC可以无限生长，并仍然保持真正的多能性。在特定条件下，它们可以分化成组成成年大脑的神经元细胞类型，包括分化的NC。分化的NC培养物是筛选有效和安全药物的有价值的疾病模型。事实上，NC培养物在药物开发中对评估药物候选物的毒性和功效非常重要。在首次给予人类患者之前，需要在体外细胞培养系统中、然后在啮齿动物和非人灵长类(NHP)物种的体内测试中彻底地评估药物候选物。目前，新药药物候选物的毒性和功效评估可以针对不同的物种采用不同的方案以不同试验形式进行。虽然药物候选物的体外测试可以减少为药物测试而处死的实验动物的数量，但这也对结果从体外到体内和人体生理学的转化提出了挑战。事实上，由于物种之间的非密切遗传关系，药物候选物的功效和毒性特征从啮齿动物物种到人类的转化可能是具有挑战性的。值得注意的是，小鼠和人类基因组的蛋白质编码区约85％相同。遗传组成的差异可能造成对药物的不同生理反应、以及对毒素或诱变剂的不同耐受性。目前，对于靶向特定DNA或RNA序列(例如，反义寡核苷酸)或基因或基因产物的遗传变体的新药类型，物种间的可转化性变得甚至更加重要。因此，鉴于遗传关系密切(>90％)，NHP物种代表了最有意义的模型系统，用于产生功效和毒性数据以预测人类的反应率和不良事件发生率。不受理论束缚，认为在NHP物种(例如，食蟹猴)中的体内测试，在所有药物类别的首次人体试验之前均是优选的，而且对于靶向确定的人类遗传组成的药物类别尤其如此。另一方面，在药物开发中使用NHP物种仍然是一个有争议的问题。NHP物种在遗传上与人类接近的这一事实引发伦理问题。因此，NHP实验动物例如食蟹猴的数量，应尽可能减少。因此，对新药候选物进行功效和毒性筛选的全面布局应该包括体外和体内NHP物种测试、以及使用IPSC来源的人类细胞的平行体外测试。测试顺序应包括，在NHP物种(例如食蟹猴)的体内试验之前，在NHP物种和人的细胞上的体外平行测试。具有较差功效和/或毒性性质的药物候选物应当，在对NHP物种开始体内测试之前，在NHP和/或人类细胞上进行体外评估时在早期阶段就予以排除。事实上，这个顺序可以确保NHP实验室动物的数量可以尽可能低。然而，从干细胞来源的分化NC获得在灵长类物种之间可转化的功效和毒性体外数据，存在许多大的障碍：首先是物种特异性的细胞培养方案和细胞培养条件的不可转化性；其次是分化中的NPCs的不均一分布，导致非最佳的存活条件或受阻的分化效应(由于局部细胞浓度和自分泌和旁分泌信号所致)，由此在药物效应的表型评估上造成困难。当培养物必须长期分化以获得所需的细胞分化状态时，这变得最为明显。最值得注意的是，分化的灵长类NC对细胞培养条件天生敏感，不能耐受苛刻的处理，这是用这些细胞产生标准化测定试验的固有障碍。因此，仍然需要一种易于获得且可重现的技术用于从不同灵长类物种(包括人类)产生一致的NC测定试验。
技术实现思路
本文提供了用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经元细胞(NC)的标准化细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)提供神经元前体细胞(NPC)；b)将NPC区分为NC，包括以下步骤：(i)在分化的约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物上解离；和(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续分化NC约4天至约15天。在一个实施方案中，灵长类物种选自人(Homosapiens)，食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)。在一个实施方案中，灵长类物种选自人(Homosapiens)和食蟹猴(Macacafascicularis)。在一个实施方案中，针对2种灵长类物种分开单独产生分化NC的标准化细胞培养物，其中第一灵长类物种是人(Homosapiens)，第二灵长类物种是食蟹猴(Macacafascicularis)。在一个实施方案中，NPC来源于诱导的多能干细胞(IPSCs)。在一个实施方案中，步骤b)包括用选自Shh，FGF8，BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的一种或多种分化剂培养NPCs。在一个实施方案中，步骤b)(i)包括在含有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中培养细胞约5至约10天的时间，接着在含有BDNF，GDNF，cAMP和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中再培养细胞约15天至约35天，然后将分化的NC从其支持物上解离。在一个实施方案中，一种或多种分化剂在基础培养基中的浓度，对于Shh是50-500ng/ml，对于FGF8是25-250ng/ml，对于BDNF是1-50ng/ml，对于BDNF是1-50ng/ml，对于cAMP是0.1-10mM，对于抗坏血酸磷酸盐是20-200μM。在一个实施方案中，一种或多种分化剂在基础培养基中的浓度，对于Shh是200ng/ml，对于FGF8是100ng/ml，对于BDNF是20ng/ml，对于GDNF是10ng/ml，对于cAMP是0.5mM，对于抗坏血酸磷酸盐是100μM。在一个实施方案中，用Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的培养期约为7天，用BDNF，GDNF，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经细胞(NC)的标准化细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)提供神经元前体细胞(NPC)；b)将NPC分化为神经细胞(NC)，包括以下步骤(i)在分化的约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物解离；和(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续分化NC约4天至约15天。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.12 EP 15194367.7;2016.09.19 EP 16189502.41.用于自不同灵长类物种产生均匀分布的分化神经细胞(NC)的标准化细胞培养物的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)提供神经元前体细胞(NPC)；b)将NPC分化为神经细胞(NC)，包括以下步骤(i)在分化的约20天至约45天后，将分化的NC从其支持物解离；和(ii)以合适的细胞培养形式再接种细胞并继续分化NC约4天至约15天。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述灵长类物种选自由人(Homosapiens)，食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)组成的组。3.根据权利要求1所述的方法，其中分化NC的标准化细胞培养物针对2种灵长类物种分别单独产生，其中所述第一灵长类物种是人(Homosapiens)，并且所述第二灵长类物种是食蟹猴(Macacafascicularis)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述NPC源自诱导的多能干细胞(IPSCs)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)(i)包括在含有Shh，FGF8和抗坏血酸磷酸盐的基础培养基中培养细胞约5至约10天的时间，随后在包含BDNF，GDNF，cA...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·克苏林，V·科斯塔，M·赫纳，C·帕奇，E·C·托马，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH