本发明专利技术提供一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法，其中步移引物包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx‑P、NSPx‑S、NSPx‑T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。本发明专利技术涉及的PCR方法能够根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列，具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。
A Step-by-Step Primer for Genome Walking and Its Application in PCR
【技术实现步骤摘要】
一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法
本专利技术涉及PCR步移
，具体涉及一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法。
技术介绍
基因组步移技术(GenomeWalking)是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2.查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。对于基因组测序已经完成的少数物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。以PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。
技术实现思路
为解决上述问题，本申请提供一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法，能够根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列。该方法具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。根据第一方面，一种实施例中提供一种用于基因组步移的步移引物，包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、NSPx-T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。进一步地，在NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。进一步地，NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQIDNO.1至SEQIDNO.9所示。根据第二方面，本实施例还提供一种使用上述的用于基因组步移的步移引物的PCR方法，包括以下步骤：第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1对待测DNA模板进行PCR反应；第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物NSP2为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP2位于SP1的5’端至3’端的内侧；第三轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP3和步移引物NSP3为扩增引物，以第二轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP3位于SP2的5’端至3’端的内侧。进一步地，在NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。进一步地，第一轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：1×LAPCRbufferII的Mg2+plus；0.4mMdNTP；0.2μMSP1；0.2μMNSPx-P；基因组DNA，微生物10-100ng或动植物100-1000ng；2.5UTaKaRaLATaqHS；适量ddH2O。进一步地，第一轮PCR反应的扩增程序为：进行5个温度为65℃的PCR反应后，以25℃为退火温度进行1个PCR反应，再进行30个温度为65℃的PCR反应。进一步地，第二轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：1×LAPCRbufferII的Mg2+plus；0.4mMdNTP；0.2μMSP2；0.2μMNSPx-S；1μL第一轮PCR反应的DNA模板；2.5UTaKaRaLATaqHS；适量ddH2O。进一步地，第二轮PCR反应的扩增程序为：以65℃的高退火温度进行5个循环的PCR反应后，以50℃的中退火温度进行1个循环PCR反应，再以65℃的高退火温度进行30个循环的PCR反应。进一步地，第三轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：1×LAPCRbufferII的Mg2+plus；0.4mMdNTP；0.2μMSP3；0.2μMNSPx-T；1μL第二轮PCR反应的DNA模板；2.5UTaKaRaLATaqHS；适量ddH2O。进一步地，第三轮PCR反应的扩增程序为：以65℃的高退火温度进行5个循环的PCR反应后，以50℃的中退火温度进行1个循环PCR反应，再以65℃的高退火温度进行30个循环的PCR反应。依据上述实施例的步移引物及其应用的方法，由于利用同一套步移引物3’端部分重叠的特点，保证了后一轮PCR的步移引物只能在较低温度下与前一轮PCR产物中的步移引物位点结合。由于每轮PCR仅使用一个25℃/50℃退火温度的PCR反应，因此随机引物只有一次机会随机退火至基因组某个位点或者前一个随机引物位点，并合成了一系列新的单链DNA。在新合成的单链中，目的单链的3’区域由于存在特异性引物的完美退火位点，在随后的一个65℃的PCR反应中转变为双链，该双链的一端为POP引物位点、另一端为特异性引物位点，从而在随后的65℃的PCR反应中得到指数扩增；非目的单链由于缺乏任一引物的结合位点，不能复制为双链，从而在随后的严谨性循环中不能扩增。因此，POP-PCR富集目的条带，同时抑制非目的片段扩增。附图说明图1为本专利技术的一实施例中的PCR反应的方法流程图；图2为本专利技术的一实施例中的第一轮PCR反应的方法示意图；图3为本专利技术的一实施例中的第二/三轮PCR反应的方法示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。说明书中方法描述的各步骤也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。本专利技术的总体构思是：设计三套步移引物，同一套步移引物3’端部分重叠，根据该特点进行非特异性PCR反应，将已知序列拼接到未知序列片段上。再通过巢式PCR反应，对拼接上已知序列的产物进一步扩增和测序，以得出未知核酸片段序列。本实施例提供一种用于基因组步移的步移引物，包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、NSPx-T，x＝1、2、3，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQIDNO.1至SEQIDNO.9所示。对于任一特定的DNA步移实验，需要根据已知序列设计3条方向一致的特异性引物，即SP1、SP2和SP3，分别与每套步移引物配对参本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于基因组步移的步移引物，其特征在于，包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx‑P、NSPx‑S、NSPx‑T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。
【技术特征摘要】
1.一种用于基因组步移的步移引物，其特征在于，包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、NSPx-T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。2.根据权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物，其特征在于，在所述NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。3.根据权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物，其特征在于，NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQIDNO.1至SEQIDNO.9所示。4.一种使用权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1对待测DNA模板进行PCR反应；第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物NSP2为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，所述SP2位于SP1的5’端至3’端的内侧；第三轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP3和步移引物NSP3为扩增引物，以第二轮PCR的产物为模板进行PCR反应，所述SP3位于SP2的5’端至3’端的内侧。5.根据权利要求4所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，在所述NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡庆贤，汪梦兰，高志良，
申请(专利权)人：蔡庆贤，
类型：发明
国别省市：广东,44
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