本发明专利技术涉及微生物领域，公开了一种生防菌HN‑2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用。所述生防菌HN‑2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN‑2，保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。其菌株及从其菌株发酵液中提取得到的提取物对有很强的抑制芒果炭疽病病原真菌的能力，其抑菌效果好，抑菌率高。只需对菌株发酵液经过简单的处理即可直接获得有效成分，制备方法简单，成本低廉，具有开发成拮抗芒果炭疽病病原真菌的新型生物农药的价值。
Application of a Biocontrol Bacterium HN-2 and its extract in preparation of antifungal agents
【技术实现步骤摘要】
一种生防菌HN-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用
本专利技术涉及微生物领域，特别是一种生防菌HN-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用。
技术介绍
芒果炭疽病是芒果生长期及储藏期的主要病害之一。它是由胶孢炭疽菌(ColletotrichumgloesporioidesPenz)侵染所引起的真菌病害，主要危害芒果的嫩稍、叶片、花和果实，造成稍枯、落花落果等。目前主要的防治措施为抗病品种的种植以及化学农药的使用。常用的化学药剂主要为：多菌灵、咪鲜胺和代森锰锌等。代森锰锌为保护性农药，其杀菌范围广且不易产生抗性。但锰锌制剂会引起作物微量元素积累中毒。咪鲜胺可以抑制麦角甾醇生物合成，兼具保护和铲除作用，可对多数子囊菌和半知菌病害有显著防效。咪鲜胺属于低毒杀菌剂，对哺乳动物和鸟类均低毒(姚庚西，2015)。多菌灵为苯并咪唑类化合物，是一种高效低毒的内吸性农药，具有保护和治疗的作用。但高浓度的多菌灵会对植物和动物产生危害，在美国和欧盟国家多菌灵为禁用药(魏中华、徐娟等，2015)。同时，长期使用化学药剂，不仅化学药剂的残留会对环境造成危害，还会导致芒果炭疽病病原真菌产生变异从而使药剂失效。脂肽类物质是芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的一类具有广谱抑制病原菌的活性化合物，该种活性成分具有低毒高效、不容易产生抗药性等特点，具有较好的生防潜力，是近年的研究重点，如何从从自然界中挖掘产生该类物质的菌株和如何提高芽孢杆菌产生脂肽类物质的产量也是研究的热点。
技术实现思路
本本专利技术提出一种生防菌HN-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种生防菌HN-2在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述生防菌HN-2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HN-2，其保藏编号为CCTCCNO:M2018382。一种生防菌HN-2的提取物在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述的提取物是从权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2中提取得到的。进一步，所述的病原真菌为芒果炭疽病病原真菌。进一步，所述的提取物为贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液离心后所得的上清液，通过正丁醇萃取、酸沉淀和/或硫酸铵沉淀得到的脂肽类物质。进一步，所述的发酵液的制备方法为：将保存的生防菌菌株HN-2接种于LB培养基上28℃活化培养，培养2天，挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床28℃，180转/分钟摇菌48小时，即得发酵液。进一步，所述的正丁醇萃取的操作方法为：发酵液离心去除菌体，即得即无菌体发酵液；加入正丁醇萃取，分离得到上层正丁醇层，去除正丁醇溶剂即得提取物。进一步，所述加入的正丁醇与无菌体发酵液的体积比为1:1。进一步，所述的酸沉淀的操作方法为：发酵液离心去除菌体，保留上清液，加入盐酸滴定至PH值为2，密封后冷藏，之后离心，弃去上清液，得到沉淀即可。进一步，所述的步骤(2)中，滴定所用的盐酸的摩尔浓度为2mol/L；冷藏的条件为4℃冷藏12小时，离心时控制转速10000转/分钟，离心10分钟。进一步，所述的硫酸铵沉淀的操作方法为：发酵液离心去除菌体，保留上清液，加入硫酸铵粉末，充分反应后，离心，弃去上清液，得到沉淀即可。本专利技术的有益效果：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HN-2是从豇豆中分离筛选得到的，已经于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2018382。其菌株及从其菌株发酵液中提取得到的提取物对有很强的抑制芒果炭疽病病原真菌的能力，其抑菌效果好，抑菌率高。只需对菌株发酵液经过简单的处理即可直接获得有效成分，制备方法简单，成本低廉，具有开发成拮抗芒果炭疽病病原真菌的新型生物农药的价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为HN-2菌株对芒果炭疽病病原菌的抑制效果；图2不同浓度的正丁醇提取物对芒果炭疽病病原真菌的抑制效果；图中，(1)为对照组，(2)为终浓度20μg/mL；(3)为终浓度为50μg/mL，(4)终浓度为100μg/mL，(5)终浓度为250μg/mL，(6)终浓度为500μg/mL；图3正丁醇提取物对对芒果炭疽病病原真菌菌丝的影响；图中，(1)为空白对照组；(2)HN-2发酵液正丁醇提取物图4正丁醇提取物对芒果果实表面防效图中，A:无处理对照组B：只接种PDA固体培养基E：左边涂抹HN-2正丁醇提取物并接菌，右边涂抹无菌水并接菌。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一、3种贝莱斯芽孢杆菌HN-2提取物的制备(1)正丁醇萃取法制备化合物将保存的生防菌菌株HN-2接种于LB培养基上28℃活化培养，培养2天，挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床28℃，180转/分钟摇菌48小时，即得到发酵液，利用高速离心机，10000转/分钟离心10分钟去除菌体，保留上清液即得无菌体发酵液。按无菌体发酵液与正丁醇为1:1的比例加入正丁醇，使两种溶液充分混合后静止过夜(12小时)，用分液漏斗萃取得到上层正丁醇，利用旋转蒸发仪，蒸出有机溶剂正丁醇即得到本申请所述的化合物。(2)盐酸沉淀法制备化合物参照实施例1的方法制得无菌体发酵液，用2mol/L的盐酸滴定，调节发酵液PH值,使PH值调节到2时停止滴加盐酸，封口放入4℃冰箱冷藏过夜(12小时)，再利用高速离心机4℃，10000转/分钟，离心10分钟，弃去上清液，得到沉淀，沉淀即是本申请所述的化合物。(3)硫酸铵饱和沉淀法制备化合物参照实施例1的方法制得无菌体发酵液，菌液10000转/分钟离心10min，缓慢加入硫酸铵粉末，沉淀蛋白，4℃静置过夜(12小时)，待充分反应后，离心得到沉淀，即为本申请所述的化合物。为了便于保存，上述实施例中所得的粗提物利用冷冻干燥机进行干燥得到干粉末再进行保存。二、HN-2菌株对芒果炭疽病病原真菌的抑菌试验将芒果炭疽病病原真菌接种到9cmPDA培养平板上，在距离中央位置2.5cm的地方对称放置两个牛津杯，并在牛津杯中接种HN-2菌株，重复三组。将培养皿正置并放于28℃暗箱中培养。待芒果炭疽病病原菌长至整个培养皿的2/3时进行抑菌观察。其结果如图1所示。抑制率计算公式为：其中I——真菌菌丝抑制率；D0——空白对照组真菌菌落增长直径；D1——药剂处理组真菌菌落增长直径。试验结果表明：按公式(1)进行计算，可算得HN-2菌株对芒果炭疽病病原真菌的抑制率为48.01％。三、生防菌HN-2抑菌活性成分粗提取方法及对真菌孢子萌发影响测试(1)纸碟法对真菌孢子平板测试将芒果炭疽病病原真菌活化后，接种在100mL，CMC液体培养基中，28℃，180转培养3-5d。用四层纱布本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生防菌HN‑2在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述生防菌HN‑2为贝莱斯芽孢杆菌HN‑2，其保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。
【技术特征摘要】
1.一种生防菌HN-2在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述生防菌HN-2为贝莱斯芽孢杆菌HN-2，其保藏编号为CCTCCNO:M2018382。2.一种生防菌HN-2的提取物在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述的提取物是从权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2中提取得到的。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的病原真菌为芒果炭疽病病原真菌。4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的提取物为贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液离心后所得的上清液，通过正丁醇萃取、酸沉淀和/或硫酸铵沉淀得到的脂肽类物质。5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的发酵液的制备方法为：将保存的生防菌菌株HN-2接种于LB培养基上28℃活化培养，培养2天，挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床28℃，180转/分钟摇菌48小时，即得发酵液。6.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：靳鹏飞，王雨，缪卫国，刘文波，王皓楠，谭峥，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46
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