本发明专利技术提供了一种杂环胺8‑MeIQx半抗原、抗体及其制备方法和应用，涉及杂环胺半抗原合成、人工完全抗原和抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立。本发明专利技术针对杂环胺检测的高通量和快速样品制备的要求，克服了已有理化分析方法繁琐复杂、成本较高、分析速度慢的问题，建立了灵敏、高效、快速、准确的免疫分析技术。使用该抗体建立的检测食品中杂环胺的方法具有良好的灵敏度并可以同时识别包括8‑MeIQx在内的8种极性杂环胺，具有良好的广谱性，检测限(以8‑MeIQx计算)为10.92μg/L，并且检测方法成本低廉，操作简便，适合于食品中极性杂环胺总量的快速检测。
A Heterocyclic Amine 8-MeIQx Hapten, Antibody and Its Preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种杂环胺8-MeIQx半抗原、抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于小分子化合物免疫化学和痕量残留分析
；涉及有机合成，免疫化学，生物化学及物化测试技术等；特别涉及小分子化合物杂环胺8-MeIQx半抗原、人工抗原的设计合成和免疫动物特异性抗体的制备及其免疫分析方法的建立。
技术介绍
杂环胺(HAAs)是一类含有N杂环的多环芳香族化合物，由自由氨基酸、肌氨酸、肌酸酐与糖类高温反应产生，具有致癌、致突变活性。杂环胺广泛存在于煎炸食品、咖啡饮料、酒类、卷烟烟气、人体体液、河水和大气中。目前已经有超过25种杂环胺类物质被分离鉴定出来。杂环胺具有很高的致癌和致突变能力，动物实验研究表明，它能诱导啮齿类和灵长类动物的多种器官产生肿瘤，并能引起哺乳动物的基因突变、染色体畸变和姐妹染色体互换。1993年，国际癌症研究机构把MeIQ，MeIQx，PhIP，AαC，MeAαC，Trp-P-1，Trp-P-2和Glu-P-1这8种HAAs作为2B类致癌物(潜在致癌物)，IQ作为2A类致癌物(可疑致癌物)；美国卫生和人力资源服务部在10次(2002年)和11次(2004年)人类致癌物报告中将IQ、MeIQ、MeIQx、PhIP列为人类致癌物，一些杂环胺的致癌、致突变型甚至强于苯并吡和黄曲霉毒素B1；美国毒理学报告也把杂环胺类化合物列为人类的可能致癌物，建议减少其暴露量。杂环胺在烹调肉制品中仅以痕量水平存在，并且烹调后肉制品的组分相当复杂，常采用高效的分离富集和灵敏的检测方法，但是由于大部分杂环胺极性较大且难挥发，只有少数杂环胺经衍生化后可采用GC或GC-MS检测，但应用并不广泛。随着超高效液相色谱(UPLC)这种强有力的分离技术的发展，超高效液相色谱串联二级质谱(UPLC-MS-MS)也被应用于杂环胺的检测，但是该类方法对仪器依赖性很高，检测时的技术要求较高，过程繁琐。而酶联免疫分析技术(ELISA)是基于免疫学反应，通过简单的抗原和抗体特异性结合的原理，根据显色就可以检测目标物，检测方法快速、灵敏、准确、成本低且操作简单，比较适合对杂环胺进行痕量分析。ELISA研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。杂环胺8-MeIQx分子量为213.24，属于小分子化合物(MW≤1000dolton)，小分子化合物一般不具有人工抗原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。虽然小分子化合物不具有人工抗原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可进行体外定量，遵循质量作用定律。所以可以使用免疫分析技术在目标分析物所对应抗原和抗体的特异性结合，通过体外对目标分析物的识别应用到痕量分析中。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过设计合成杂环胺8-MeIQx半抗原及制备相应的人工完全抗原和抗体。本专利技术的另一个目的是提供杂环胺8-MeIQx的半抗原及相应的人工完全抗原和抗体的制备方法。本专利技术再一个目的是提供杂环胺8-MeIQx的半抗原及相应的人工完全抗原和抗体的应用，其中杂环胺8-MeIQx的人工完全抗原包括免疫原和包被原。本专利技术的独特之处在于选择具有喹啉类、喹喔啉类和吡啶类极性杂环胺通用结构的2-氨基-3,8二甲基咪唑[4,5-f]喹喔琳(8-MeIQx)的咪唑环氨基为合成作用位点，进一步将杂环胺8-MeIQx和琥珀酸酐合成了带有羧基活性基团的半抗原。通过对半抗原偶联蛋白制备了免疫原，免疫动物诱导产生亲合性高、可以广谱性识别多种极性杂环胺的多克隆抗体，并以此为基础建立了ELISA方法即快速免疫分析方法，准确检测食品中的喹啉类、喹喔啉类和吡啶类的多种极性杂环胺总量。本专利技术利用目标分析物半抗原与载体蛋白质偶联，制备有效免疫原，免疫动物制备对小分子分析物的多克隆抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量地检测样本中超微量小分子目标分析物，即可用于样本测定。其选择性决定于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此可以快速准确地分析检测杂环胺在样本中的含量。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工完全抗原及抗体的制备。人工完全抗原是半抗原与载体蛋白的偶联物，若用于免疫动物，即为免疫原，若用于免疫分析中包被微孔板，即为包被原。对于同一种目标分子，免疫原和包被原通常不用同一种偶联物，目的是减少抗体对包被原的非特异性结合，提高分析的特异性和灵敏度。因为免疫原免疫动物所产生的抗体，不仅能识别半抗原，也能识别载体蛋白。因此，免疫原和包被原所用的载体蛋白一般是不相同的，载体蛋白的结构和分子质量差异越大，非特异性结合反应越弱，分析灵敏度越高。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种杂环胺8-MeIQx半抗原，分子结构式为：所述的杂环胺8-MeIQx半抗原的制备方法，包括以下步骤：将20mg琥珀酸酐溶于5mL无水二氯甲烷，加入溶有21mg8-MeIQx的15mL无水二氯甲烷溶液中并在40℃下回流3h，并由薄层色谱(ThinLayerChromatography,TLC)监测(展开剂组分及比例为二氯甲烷：无水甲醇：氨水＝9：1：0.1，v/v)，反应终止后，60℃减压旋蒸除去溶剂即得到杂环胺8-MeIQx半抗原(分子量：313.31)。一种杂环胺8-MeIQx免疫原，杂环胺8-MeIQx免疫原分子结构式为：一种杂环胺8-MeIQx免疫原的制备方法，由上述的杂环胺8-MeIQx半抗原与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备而成，包括以下步骤：(1)称取杂环胺8-MeIQx半抗原0.97mg于4mL棕色瓶中，用400μLDMF溶解；(2)称取1.07mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、0.9mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入到棕色瓶中，室温搅拌18h，进行活化；(3)称取20mgKLH蛋白溶解在4mL的pH8.0的磷酸缓冲液中；(4)将(2)制得的活化液缓慢滴加到蛋白质溶液中，5μL/2min，加完后，4℃反应12h；(5)将步骤(4)所得反应溶液在4℃用pH7.4的0.01M的磷酸缓冲液中透析3d，每天换四次透析液，最后将透析液取出，得到杂环胺8-MeIQx免疫原。一种杂环胺8-MeIQx包被原，其特征在于，包被原分子结构式为：一种杂环胺8-MeIQx包被原的制备方法，由上述的杂环胺8-MeIQx半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备而成，包括以下步骤：(1)称取13.8mg杂环胺8-MeIQx半抗原于4mL棕色瓶中，用400μLDMF溶解；(2)称取15.2mgNHS、12.6mgEDC加入到棕色瓶中，室温搅拌18h，进行活化；(3)称取20mgOVA蛋白溶解在4mL的pH8.0的磷酸缓冲液中；(4)将(2)制得的活化液缓慢滴加到蛋白质溶液中，5μL/2min，加完后，4℃反应12h；(5)将所得反应溶液在4℃用pH7.4的0.01M的磷酸缓冲液中透析3d，每天换四次透析液，最后将透析液取出，得到杂环胺8-MeIQx包被原。一种杂环胺8-MeIQx抗体，所述杂环胺8-MeIQx抗体能与上述包被原发生特异性免疫反应的多克隆抗体。杂环胺8-M本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种杂环胺8‑MeIQx半抗原，其特征在于，分子结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种杂环胺8-MeIQx半抗原，其特征在于，分子结构式为：2.权利要求1所述的杂环胺8-MeIQx半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将20mg琥珀酸酐溶于5mL无水二氯甲烷，加入溶有21mg8-MeIQx的15mL无水二氯甲烷溶液中并在40℃下回流3h，并由薄层色谱监测，展开剂组分及比例为二氯甲烷：无水甲醇：氨水＝9：1：0.1(v/v)，反应终止后，60℃减压旋蒸除去溶剂即得到杂环胺8-MeIQx半抗原，分子量：313.31。3.一种杂环胺8-MeIQx免疫原，其特征在于，杂环胺8-MeIQx免疫原分子结构式为：4.一种权利要求3所述杂环胺8-MeIQx免疫原的制备方法，其特征在于，由权利要求1所述的杂环胺8-MeIQx半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联制备而成，包括以下步骤：(1)称取杂环胺8-MeIQx半抗原0.97mg于4mL棕色瓶中，用400μLDMF溶解；(2)称取1.07mgNHS、0.9mgEDC加入到棕色瓶中，室温搅拌18h，进行活化；(3)称取20mgKLH蛋白溶解在4mL的pH8.0的磷酸缓冲液中；(4)将(2)制得的活化液缓慢滴加到蛋白质溶液中，5μL/2min，加完后，4℃反应12h；(5)将步骤(4)所得反应溶液在4℃用pH7.4的0.01M的磷酸缓冲液中透析3d，每天换四次透析液，最后将透析液取出，得到杂环胺8-MeIQx免疫原。5.一种杂环胺8-MeIQx包被原，其特征在于，包被原分子结构式为：6.一种权利要求5所述杂环胺8-MeIQx包被原的制备方法，其特征在于，由权利要求1所述的杂环胺8-MeIQx半抗原与卵清蛋白偶联制备而成，包括以下步骤：(1)称取13.8mg杂环胺8-MeIQx半抗原于4mL棕色瓶中，用400μLDMF溶解；(2)称取15.2mgNHS、12.6mgEDC加入到棕色瓶中，室温搅拌18h，进行活化；(3)称取20mgOVA蛋白溶解在4mL的pH8.0的磷酸缓冲液中；(4)将(2)制得的活化液缓慢滴加到蛋白质溶液中，5μL/2min，加完后，4℃反应12h；(5)将所得反应溶液在4℃用pH7.4的0.01M的磷酸缓冲液中透析3d，每天换四次透析液，最后将透析液取出，得到杂环胺8-MeIQx包被原。7.一种杂环胺8-MeIQx抗体，其特征在于，所述杂环胺8-MeIQx抗体能与权利要求5包被原发生特异性免疫反应的多克隆抗体。8.权利要求7所述杂环胺8-MeIQx抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：免疫动物选用雌性大白兔，首次免疫采用背部多点皮...
【专利技术属性】
技术研发人员：生威，王硕，赵秋霞，张燕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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