基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了提供一种基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用。该单位点SSR引物组是专门针对老芒麦植物开发的特异单位点SSR，利用本发明专利技术所述的10对引物对老芒麦种质材料进行扩增，解决了通用多位点SSR标记无法计算观测杂合度的问题，利用本发明专利技术所述的单位点SSR引物计算得到的各项遗传多样性指标相对于通用的多位点SSR引物而言准确度更高，更能准确的揭示老芒麦物种丰富的遗传多样性，同时利用本发明专利技术所述的10对单位点SSR引物就能准确的得到未知老芒草物种的群体信息。适合在SSR引物组领域推广运用。

Unit-point SSR primers based on genome sequence development of Eriocheir sibirica and their application

【技术实现步骤摘要】
基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用
本专利技术属于SSR引物组领域，具体涉及一种基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用。
技术介绍
老芒麦(ElymussibiricusL.)是披碱草属(ElymusL.)的模式种，为异源四倍体，具有StStHH的染色体组构成(2n＝4x＝28)，在我国主要分布于新疆、四川、西藏、青海、甘肃、内蒙古等地区。老芒麦也是青藏高原高寒牧区应用最为广泛的优良牧草资源，具有适应性强、抗寒、粗蛋白含量高、适口性好和易栽培等优良特性，主要用于建植人工草地和放牧草地，是高寒地区退化草地补播和改良的主要草种，尽管老芒麦具有重要的生态和经济效益，但其种质资源研究工作仍较为薄弱，尤其分子水平研究较少，主要集中于老芒麦种质资源遗传多样性的研究与DNA指纹图谱的构建。虽较多分子标记如AFLP、ISSR、SRAP、SSR、EST-SSR和SCoT等运用于老芒麦研究中，但它们大多采用运用于其他物种上的通用引物，而有关老芒麦特异引物的报道却较少，导致老芒麦的育种进程停滞不前。因此，丰富老芒麦特异引物库已成为当务之急。简单重复序列(SSR，SimpleSequenceRepeat)又称为微卫星DNA，是分子标记辅助育种首选标记之一。其以2-6个核苷酸为基本单位的串联重复序列组成的DNA片段，长度大多为100-200个碱基对，具有分布广泛，多态性丰富，重复性好，共显性遗传，物种间转移性好等特点，已被广泛应用于品种鉴定，种质资源保存和利用、遗传多样性分析、分子标记辅助选育等研究领域。SSR分子标记是一种共显性标记，能够同时区分纯合和杂合基因型。SSR分子标记包含两种类型：其引物在PCR扩增过程中与多个基因座结合的多位点(multi-loci)SSR标记和只与一个特异基因座结合的单位点(single-loci)SSR标记，两者的主要区别在于：在多倍体物种的多态性分析中，多位点标记引物会在扩增过程中与多个基因座位点相结合，从而产生片段重叠扩增，同源性模糊等问题，导致其PCR产物的结果产生复杂的条带类型，致使无法用共显性标记方来准确进行基因分型，而单位点SSR标记引物可结合到特定基因组的基因座上，在二倍体和遵循二倍体遗传模式的异源四倍体物种上应用时能避免这些缺点，并精确计算观测杂合度(Ho)和多态性信息含量(PIC)。并在在一系列重要的分子遗传参数多态性信息含量(PIC)上比多位点标记更加精准，因此在遗传育种研究中更具有优势。SSR虽是以测序技术为基础的分子标记，但随着目前二代测序的越来越普遍以及三代测序的兴起，其开发费用的逐渐降低，加速了它在物种上的开发利用。迄今，未见结合基因组Survey测序技术运用于老芒麦植物并开发老芒麦特异单位点SSR分子标记开发应用的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组，该内参基因为芒草基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案为：该基于芒草转录组序列开发的内参基因，所述单位点SSR引物组包括10对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示。本专利技术还发现了基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组在老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析中的应用。本专利技术还提供了利用所述基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，包括如下步骤：A、提取待测老芒麦样品基因组DNA；B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目得到统计结果；D、利用步骤C的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算观测杂合度(Ho)与多态信息含量(PIC)，多态信息含量其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pi表示标记的第i个等位基因出现的频率，n为等位基因数量；观测杂合度u表示纯合子等位基因个体的频率，n为等位基因数量；所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS2.10和软件Figtree基于遗传距离矩阵对待测老芒麦样品材料进行UPGMA聚类，使用基于贝斯叶算法开发的Structure2.3.4软件来分析参试老芒麦群体结构，并通过Genlex6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)，观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。进一步的是，在步骤A中，提取待测老芒麦样品基因组DNA的具体方法如下所述：选取待测老芒麦样品的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用。进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括3μL浓度为10ng/μL的模板DNA，7.5μL的2XReactionMix，0.4μL的GoldenDNAPolymerase，0.8μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.8μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-65℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述的基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组是专门针对老芒麦植物开发的特异单位点SSR，利用本专利技术所述的10对引物对老芒麦种质材料进行扩增，解决了通用多位点SSR标记无法计算观测杂合度的问题，本专利技术单位点SSR标记可以计算得到观测杂合度，同时计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)也远高于通用的多位点SSR标记扩增后计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)，因此，利用本专利技术所述的单位点SSR引物计算得到的各项遗传多样性指标相对于通用的多位点SSR引物而言准确度更高，更能准确的揭示老芒麦物种丰富的遗传多样性，同时利用本专利技术所述的10对单位点SSR引物就能准确的得到未知老芒草物种的群体信息。附图说明图1为基于单位点SSR标记遗传距离矩阵的23份参试老芒麦UPGMA聚类图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术所述基于老芒麦基因组序列开发的10对单位点SSR引物组采用如下方法获得：对“川草2号”老芒麦幼叶进行基因组测序，四倍体老芒麦基因组序列集由四川农业大学草业科学系通过基因组Survey测序获得，使用PERL5scriptMIcroSAtellite软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)在该序列集中识别SSRs，从FASTA格式的基因组序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组，其特征在于：所述单位点SSR引物组包括10对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示。

【技术特征摘要】
1.基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组，其特征在于：所述单位点SSR引物组包括10对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示。2.根据权利要求1所述的基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组在老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析中的应用。3.利用权利要求1所述基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，包括如下步骤：A、提取待测老芒麦样品基因组DNA；B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目得到统计结果；D、利用步骤C的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算观测杂合度(Ho)与多态信息含量(PIC)，多态信息含量其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pi表示标记的第i个等位基因出现的频率，n为等位基因数量；观测杂合度u表示纯合子等位基因个体的频率，n为等位基因数量；通过Genlex6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)和期望杂合度(He)；所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS...

【专利技术属性】
技术研发人员：白史且，马啸，鄢家俊，伍文丹，李达旭，常丹，游明鸿，雷雄，
申请(专利权)人：四川省草原科学研究院，四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51