【技术实现步骤摘要】
一种转氨酶-辅酶共固定化工程菌细胞及应用(一)
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种转氨酶-辅酶共固定化微生物细胞的方法及以共固定化细胞为催化剂，合成西他列汀药物中间体(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法。(二)
技术介绍
糖尿病是一种因胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为主要特征的慢性代谢疾病。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(Insulin-dependentdiabetesmellitus,IDDM,又称Ⅰ型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulindependentdiabetesmellitus,NIDDM,又称Ⅱ型糖尿病)。其中Ⅱ型糖尿病占总发病率的90％。糖尿病还会引起多种并发症，包括：视网膜病变引起的视力障碍和失明、终末期肾病、增加心血管患病率和死亡率、下肢血管病变引起的截肢等疾病，是严重威胁人类健康的一种多发病。因此，如何有效地防控和治疗糖尿病成为了医药和生物等领域的研究热点。西他列汀(Sitagl...
【技术保护点】
1.一种转氨酶‑辅酶磷酸吡哆醛共固定化基因工程菌细胞，其特征在于所述共固定化基因工程菌细胞按如下方法制备：将转氨酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH9.0、100mM甘氨酸缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入辅酶PLP，在20‑30℃，500rpm条件下水浴搅拌30min；再向菌悬液中加入活性炭，在20‑30℃，500rpm条件下水浴搅拌30min；然后加入质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液，在20‑30℃，500rpm条件下水浴搅拌交联1h；最后加入质量浓度50％戊二醛水溶液，在20‑30℃，500rpm条件下水浴搅拌交联1h，抽滤，滤饼用pH9.0、100mM甘氨酸缓冲...
【技术特征摘要】
1.一种转氨酶-辅酶磷酸吡哆醛共固定化基因工程菌细胞，其特征在于所述共固定化基因工程菌细胞按如下方法制备：将转氨酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH9.0、100mM甘氨酸缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入辅酶PLP，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌30min；再向菌悬液中加入活性炭，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌30min；然后加入质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌交联1h；最后加入质量浓度50％戊二醛水溶液，在20-30℃，500rpm条件下水浴搅拌交联1h，抽滤，滤饼用pH9.0、100mM甘氨酸缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得转氨酶-PLP共固定化细胞；所述菌悬液中湿菌体含量为50g/L；所述辅酶PLP加入量为0.1-2g/L，活性炭加入量以菌悬液体积计为5-20g/L；所述聚乙烯亚胺水溶液体积用量以菌悬液体积计为2-6％；所述戊二醛水溶液体积用量以菌悬液体积计为0.4-2％。2.如权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化基因工程菌细胞，其特征在于所述转氨酶基因工程菌是由SEQIDNO.1所示核苷酸序列导入大肠杆菌获得。3.如权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化基因工程菌细胞，其特征在于所述活性炭为颗粒活性炭，在加入前先进行预处理，所述预处理方法为：将活性炭过40目筛，再加入1M盐酸中，50℃搅拌1h，抽滤，用蒸馏水清洗滤液至中性，滤饼烘干，即为预处理后的活性炭。4.如权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化基因工程菌细胞，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以体积浓度10％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃，500rpm下培养至菌体OD600达6～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h，发酵液4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。5.权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化基因工程菌细胞在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。6.一种利用权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化基因工程菌细胞不对称还原制备西他列汀中间体中的方法，其特征在于所述方法包括：(1)将转氨酶基因工程菌经...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，范浩浩，王鑫鑫，张晓健，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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