用于结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA‑54265检测试剂盒。该试剂盒包含有piRNA‑54265检测引物组合，包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA‑54265的RNA序列中的U改成T，从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基。本发明专利技术原创性首次针对piRNA‑54265提供了特定的引物设计模式，据此设计的引物扩增效率及特异性俱佳。本试剂盒提供了从样本RNA纯化至含量检测的完整过程，流程优化，操作简便高效，适用的待测样本包括组织、细胞，细胞上清、血清（血浆）、尿液、唾液等体液以及其余各类RNA稀有样本，所需样本量较市面同类型试剂盒少，适用范围广。

PiRNA-54265 Detection Kit for Early Screening, Diagnosis, Therapeutic Effect and Prognosis Evaluation of Colorectal Cancer

【技术实现步骤摘要】
用于结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒
本专利技术属于生物医学检测
更具体地，涉及一种用于人结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是世界范围内常见的胃肠道肿瘤，在我国恶性肿瘤中位居前列，结直肠癌隐匿性强，大多患者发现时已是中晚期临床治疗效果不佳，是全球范围内致人死亡的重要病因之一。而早期结直肠癌患者手术切除率高，复发转移少，五年总生存显著提高。因此，结直肠癌早期诊断尤其是早期筛查具有重要意义。目前，肠镜检查作为早期诊断的重要手段，准确率高，但由于经济成本高、操作人员及设备要求高、体检者依从性差，并不利于普及早期筛查。因此，寻找及开发出经济简便、高灵敏度特异度的生物标志物进行结直肠癌的早期筛查和诊断，意义重大。Piwi-interactingRNA(简称piRNA)是一类长度约26-31nt的单链非编码RNA，在转座子抑制和基因表达调控方面行使重要功能。越来越多的研究发现，某些特定piRNA在胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中异常表达，而扰动这些肿瘤细胞中特定的piRNA能影响诸如增殖、转移、侵袭等细胞恶性表型。因此，piRNA在肿瘤的发生发展中可能发挥重要作用。本课题组研究发现piRNA-54265在结直肠癌与癌旁组织中的表达具有显著统计学差异，piRNA-54265在癌组织中高表达。piRNA-54265在癌组织中表达量的高低与结直肠癌患者的生存预后相关，piRNA-54265高表达组结直肠癌患者预后较差。结直肠癌患者血清中能够检测到piRNA-54265，其在血清中的含量与在癌组织中的含量呈正相关性，并与患者生存预后相关；在非结直肠癌的正常人血清中，piRNA-54265含量极低，与结直肠癌患者血清piRNA-54265含量比较，差异显著并很容易区分。敲降piRNA-54265后，结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力等均明显减弱，能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长及癌细胞的远处转移及定植。增加或降低piRNA-54265的表达水平，结直肠癌细胞均表现出一定程度的化疗敏感性降低或增强；piRNA-54265高表达患者，化疗近期疗效较差。而且，血清piRNA-54265能有效预测结直肠癌，可在确诊3年前患者的血液中检测到异常高表达的piRNA-54265，因此能在正常人群中进行结直肠癌的早期筛查及早期诊断，有效预测时间比临床确诊提早至少三年。因此，以piRNA-54265作为结直肠癌早筛、诊断、预后监测靶标开发相关诊断试剂盒具有重要意义和应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：基于本课题组的研究成果，piRNA-54265在血清中稳定表达，piRNA-54265在结直肠癌患者血清中特异性高表达，并且与肿瘤分期正相关(piRNA-54265的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)。前瞻性自然人群队列研究表明血清piRNA-54265水平可预测结直肠癌的发病，并且可比临床确诊提早3年。因此piRNA-54265可以作为结直肠癌早筛、诊断、疗效评价、预后判断的生物标志物。进一步开发了piRNA-54265的检测试剂盒，可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价。具体地，一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒，其包含有用于特异性检测piRNA-54265的引物，所述引物为定量PCR引物对，包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA-54265的RNA序列中的U改成T、从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基所得到。作为一种优选地可选择方案，所述引物对可为piRNA-54265茎环法PCR引物对，或piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对。优选地，所述piRNA-54265茎环法PCR引物对如SEQIDNO.8/9、SEQIDNO.10/9、SEQIDNO.11/9、SEQIDNO.12/13、SEQIDNO.14/13、SEQIDNO.15/13、SEQIDNO.16/13、SEQIDNO.17/13、SEQIDNO.18/13、SEQIDNO.19/13或SEQIDNO.20/13所示。优选地，所述piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对如SEQIDNO.8/21、SEQIDNO.10/21、SEQIDNO.11/22、SEQIDNO.12/22、SEQIDNO.14/23、SEQIDNO.15/22、SEQIDNO.16/22、SEQIDNO.17/22、SEQIDNO.18/22、SEQIDNO.19/22、或SEQIDNO.20/22所示。最优选地，茎环法引物对的前向引物和反向引物分别如SEQIDNO.26和SEQIDNO.9所示。最优选地，加polyA尾法引物对的前向引物和反向引物分别如SEQIDNO.26和SEQIDNO.22所示。另外，所述试剂盒还包括配合所述引物使用的探针。优选地，与茎环法引物配合使用的探针如SEQIDNO.27所示。另外，所述试剂盒还包括样本RNA逆转录引物。优选地，piRNA-54265茎环法逆转录引物序列如SEQIDNO.2所示。优选地，piRNA-54265加PolyA尾法逆转录引物序列如SEQIDNO.3-5所示。另外，优选地，本专利技术上述试剂盒使用时，若采用实时荧光定量PCR，其反应体系如表13，表14，反应程序如表15。若数字PCR，其反应体系如表16，反应程序如表17。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒，本专利技术原创性首次针对piRNA-54265提供了特定的引物设计模式，并验证了其引物设计的扩增效率及特异性俱佳。本试剂盒提供了从样本RNA纯化至含量检测的完整过程，流程已优化，操作简便高效。而且，该试剂盒使用时，待测样本适合于包括组织、细胞，以及细胞上清、血清(血浆)、尿液、唾液等体液以及其余各类RNA稀有样本，所需的样本量较市面同类型试剂盒少；同时提供了两种可选的含量检测方法包括与数字PCR绝对定量法进行，适用范围广。附图说明图1：茎环引物法和加PolyA尾法PCR引物设计模式示意图。图2：茎环法11对引物的扩增曲线和融解曲线。图3：加PolyA尾法11对引物的扩增曲线和融解曲线。图4：茎环法和加PolyA尾法的最优引物对应的扩增曲线和融解曲线。图5：试剂盒实时荧光定量PCR检测随访中未发病的对照一例(正常人)，随访中发病的病例一例(取样时未发病，为结直肠癌患者发病前)，高级别上皮内瘤变一例，结直肠癌患者两例(Ⅰ期和Ⅳ期)血清piRNA-54265水平。图6：试剂盒实时荧光定量PCR检测结直肠癌患者术前，术后第1天，第3天，第5天，第7天血清piRNA-54265水平；6a患者术前和术后第1，3，5，7天血清piRNA-54265和外参cel-miR-39的扩增曲线。6b为相应的融解曲线。图7：试剂盒数字PCR检测正常人和结直肠癌患者治疗前血清piRNA-54265水平结果。图8：p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的piRNA‑54265检测引物组合，其特征在于，包含有用于特异性检测piRNA‑54265的引物对，包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA‑54265的RNA序列中的U改成T、从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基所得到。

【技术特征摘要】
1.一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的piRNA-54265检测引物组合，其特征在于，包含有用于特异性检测piRNA-54265的引物对，包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA-54265的RNA序列中的U改成T、从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基所得到。2.根据权利要求1所述引物组合，其特征在于，所述引物对为piRNA-54265茎环法PCR引物对，或piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对。3.根据权利要求2所述引物组合，其特征在于，所述piRNA-54265茎环法PCR引物对如SEQIDNO.8/9、SEQIDNO.10/9、SEQIDNO.11/9、SEQIDNO.12/13、SEQIDNO.14/13、SEQIDNO.15/13、SEQIDNO.16/13、SEQIDNO.17/13、SEQIDNO.18/13、SEQIDNO.19/13或SEQIDNO.20/13所示。4.根据权利要求2所述引物组合，其特征在于，所述piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对如SEQIDNO.8/21、SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：林东昕，郑健，麦冬梅，
申请(专利权)人：中山大学，中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44