一种MRFFT1细胞的构建方法技术

技术编号:21793277 阅读:68 留言:0更新日期:2019-08-07 09:11
本发明专利技术涉及一种MRFFT1细胞的构建方法,通过抗原表位预测筛选出突变多肽,连接并合成突变多肽表达基因序列;同时构建MVA病毒载体,包装MVA病毒,转染APC细胞,完成特异性MV细胞的改造,体外与从外周血中分离的PBMC共培养,筛选出有效多肽,通过精准有效多肽刺激的第二次冲击,将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞,再利用TCR-T技术原理进行了改造,改造后的T细胞再用基因编缉技术对其进行免疫抑制靶点的敲除,精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制,提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

Construction of MRFFT1 cells

【技术实现步骤摘要】
一种MRFFT1细胞的构建方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种MRFFT1细胞的构建方法。
技术介绍
目前,在肿瘤的特异性免疫治疗方面,现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的,而NK、CAR-NK、TIL等细胞技术还有待成熟,CAR-T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞,由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞,诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC,诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术,靶向递呈MAGEA3抗原。以上治疗方法并不成熟,尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多,但在具体实施过程中还有许多问题,缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原,因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍,使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外,有的虽然进行了抗原体外冲击,但没有进行体外共培育和体外扩增,让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤免疫微环境,因此,很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MRFFT1细胞的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括如下步骤:1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点,以突变的氨基酸位点为中心,向两侧各延伸8个氨基酸,将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位,使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50,如IC50<1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位;2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50,IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性,将弱免疫原性的抗原表位连接在一起,合成连接后的突变多肽的基因序列;3)构建表达所述突变多肽的MVA病毒载体,包装MVA病毒;4)使用所述MVA病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养,获得MFF细胞;5...

【技术特征摘要】
2018.09.30 CN 20181115325561.一种MRFFT1细胞的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括如下步骤:1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点,以突变的氨基酸位点为中心,向两侧各延伸8个氨基酸,将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位,使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50,如IC50<1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位;2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50,IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性,将弱免疫原性的抗原表位连接在一起,合成连接后的突变多肽的基因序列;3)构建表达所述突变多肽的MVA病毒载体,包装MVA病毒;4)使用所述MVA病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养,获得MFF细胞;5)所述突变多肽作为抗原刺激所述MFF细胞,通过检测IFN-γ的分泌,筛选出有效的精准多肽;6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述MFF细胞,对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN-γ的染色,并以流式细胞仪进行分选,筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞,测序并得到特异性细胞的高频TCR基因;7)利用CRISPR技术敲除外周血T细胞中原有的TCR基因,转入上步所述高频TCR基因,获得TCR-T细胞;8)利用CRISPR技术敲除细胞表面免疫抑制性信号分子,即得MRFFT1细胞。2.如权利要求1所述的MR...

【专利技术属性】
技术研发人员:焦顺昌张嵘周子珊宋玉洁解佳森张天赋王海燕袁翰
申请(专利权)人:北京鼎成肽源生物技术有限公司焦顺昌
类型:发明
国别省市:北京,11

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