新型多价免疫球蛋白制造技术

本发明专利技术提供与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分、它们的用途和制备它们的方法，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。

New multivalent immunoglobulin

【技术实现步骤摘要】
新型多价免疫球蛋白本申请是分案申请，其母案的中国申请号是200780032991.X，国际申请号是PCT/AT2007/000313，申请日是2007年6月26日。
本专利技术提供与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分、它们的用途和制备它们的方法，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。
技术介绍
在很多治疗性、诊断性和分析应用中业已发现单克隆抗体的用途。基本的抗体结构在本文用完整的IgG1免疫球蛋白作为例子予以阐明。两条同样的重链(H)和两条同样的轻链(L)结合形成Y形抗体分子。每一条重链都有四个结构域。氨基端可变区(VH)位于Y的顶部。跟随着的是三个恒定区：CH1、CH2和羧基端CH3，CH3位于Y主干的底部。一段短的区段，即转换区，将重链的可变区和恒定区连接起来。铰链将CH2和CH3(Fc片段)与抗体其余部分(Fab片段)连接起来。完整的抗体分子通过蛋白酶在铰链处切割可产生一个Fc片段和两个同样的Fab片段。轻链由可变区(VL)和恒定区(CL)这两个结构域构成，VL和CL通过转换区分隔开。铰链区内的二硫键连接着两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。Asn-连接的碳水化合物部分视免疫球蛋白类别连接在恒定区的不同位置。对于IgG1，在Cys235和Cys238对之间的铰链区内的两个二硫键连接两条重链。轻链由位于CH1结构域的Cys229s和CL结构域的Cys214s之间的另外的两个二硫键与重链偶联。碳水化合物部分连接到每个CH2的Asn306，在Y主干形成明显的突出部分。这些特征具有意义深远的功能结果。重链和轻链两个的可变区(VH)和(VL)都位于Y的“顶部”，它们在那儿与抗原反应。分子的这一顶部是氨基酸序列N端所位于的一侧。Y主干以有效介导效应子功能的方式突出，例如补体活化和与Fc受体相互作用、或ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域突出以促进与效应蛋白的相互作用。氨基酸序列的C端位于顶部的相反一侧，可将其称为Y的“底部”。在抗体中发现命名为λ(lambda)和κ(kappa)的两种类型的轻链。特定免疫球蛋白具有κ链或λ链，从来不会一样一条。在具有λ或κ轻链的抗体之间还没有发现功能上的差别。抗体分子中的每个结构域都有一个相似的结构：两个β片层在挤压式反向平行β桶中彼此紧密堆叠在一起。这种保守结构称为免疫球蛋白折叠。免疫球蛋白恒定区折叠含有4股片层和3股片层，其中4股片层针对3股片层堆叠在一起。通过在各个片层β链之间的氢键结合、通过内部相对片层残基之间的疏水键结合和通过各片层之间的二硫键来稳定所述折叠。3股片层包含C、F和G链，4股片层有A、B、E和D链。字母A到G表示沿着免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的β链的次序位置。可变区折叠具有9个β链(betastrand)，排列在4股和5股的两个片层内。5股片层在结构上与恒定区的3股片层同源，但含有额外的C'和C''链。其余的链(A、B、C、D、E、F、G)在恒定区免疫球蛋白折叠中，与其配对物在拓扑学上相同，在结构上相似。二硫键将在相对片层中的B链和F链连接起来，如同在恒定区一样。免疫球蛋白轻链和重链可变区都含有三个高变环，即互补决定区(CDR)。V区的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β桶的一端串在一起。CDR为连接免疫球蛋白折叠的β链B-C、C'-C''和F-G的环。不同免疫球蛋白分子的CDR中的残基有变化，使得每种抗体对抗原具有特异性。抗体分子顶部的VL和VH结构域紧密堆叠在一起，使得6个CDR(每一结构域有3个)协作构建抗原特异性结合表面(或空穴)。因此，抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C'-C''和F-G链和重链可变区的B-C、C'-C''和F-G链的环组成。在天然免疫球蛋白中不是CDR环的环，或并非由CDR环决定的抗原结合口袋部分的环，不具有抗原结合或表位结合特异性，但有助于整个免疫球蛋白分子和/或其效应物的正确折叠或其它功能，因此称为结构环，供本专利技术目的用。现有技术文献表明，为了改造现有抗原结合位点并藉此引入新的结合特性的目的，迄今一直采用免疫球蛋白样支架结构。然而，迄今为止，为了抗原结合只有CDR区业已进行工程改造，换言之，在免疫球蛋白折叠情况下，为了改变其结合亲和力或特异性，只对天然抗原结合位点进行了修饰。有大量的文献记载了这种改造免疫球蛋白的不同形式，它们经常以在噬菌体颗粒表面展示或在各种原核或真核表达系统中可溶性表达的单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式来表达。PCT/EP2006/050059描述了工程改造免疫球蛋白的方法，包括在结构环区(structuralloopregion)内进行修饰以获得新的抗原结合位点。该方法广泛应用于免疫球蛋白，并可用于产生一系列靶向多种抗原的免疫球蛋白。但是，未明确描述细胞表面靶的多价结合物(binder)。US2005/266000A1描述了包含变异重链可变构架区(variableframeworkdomain，VFR)的多肽。VFR为可与抗原接触的抗原结合口袋或沟(groove)部分。VFR为CDR环区部分，位于CDR环一侧的可变区以经由CDR环区支持抗原结合。除VFR以外的构架环尚不能发生突变以用于工程改造抗原结合位点的目的。与人类癌症有关的细胞表面蛋白可能是单克隆治疗的有效靶标。抗体可通过调节细胞活化或通过补充免疫系统引起抗肿瘤反应。某些mAb通过交联靶标来实现其部分作用效果，这可以将靶标聚起来并导致活化、抑制或放大细胞信号，最后以细胞靶标的细胞停滞和/或凋亡为结果。业已证明，某些Mab(抗CD19、抗CD20、抗CD21和抗CD22)对淋巴瘤细胞系很少或没有先天抗生长活性，通过用它们作为四价同型二聚体而转化成为有效的抗肿瘤药。这些活性可通过募集效应细胞和/或补体在体内得到提高。用于治疗性mAb的另一策略是将细胞毒性药物与所述mAb偶联。这样的免疫毒素可结合细胞表面靶，接着内化，释放药物杀死该靶细胞。可能需要将靶标簇集作为内化的先决条件。为了提高mAb通过靶标分子簇集而发挥其作用的功效，已经设计了多种形式的多价Ab。业已专利技术了形成四价Ab的共价连接的全长IgG，以及经由使用其分泌尾端而模拟聚合IgM和IgA的天然存在的IgM和IgGAb。通过在全长IgG的每一H链的C端加上Fab设计出了另一种四价形式。为了让肿瘤渗透得到改进，将使用单链Fv(scFv)2片段(每一Fv由通过肽接头连接的轻链可变区和重链可变区组成)的较小的构建体连接在一起形成多价复合体。这样的构建体半衰期可能相当短(与全长mAb半衰期比较)，因此，这一问题已经通过将这些scFv多聚体与IgGFc片段连接而解决了。很难控制用scFv和相似形式形成精确的聚合度，即二聚体、三聚体、四聚体，视基础构建体和表达方法可以不同比率形成较大的复合体。产生多价免疫球蛋白的任何已知形式在免疫原性、体内半衰期或生产问题等方面都具有某些缺点。本专利技术的目的是提供模件系统(modularsystem)，该系统可根据各种需要设计靶向细胞的多价免疫球蛋白，从而解决了现有技术的这些问题。
技术实现思路
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【技术保护点】
1.与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。

【技术特征摘要】
2006.07.05 AT A1147/20061.与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。2.权利要求1的免疫球蛋白，其中经修饰的结构环区位于所述免疫球蛋白或其部分的恒定区内，优选位于CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C内。3.权利要求2的免疫球蛋白，其特征在于：所述经修饰的结构环区包含至少6个氨基酸修饰。4.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：人源或鼠源的CH1、CH2、CH3或CH4的经修饰的环区在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸内包含至少一个修饰。5.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：人源Igk-C或Igl-C的环区在第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸或第123-126位氨基酸内包含至少一个修饰。6.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：鼠源Igk-C或Igl-C的环区在第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸或第122-125位氨基酸内包含至少一个修饰。7.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白恒定区为骆驼源的。8.权利要求7的免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白包含选自CH1、CH2和CH3的至少一个经修饰的恒定区。9.权利要求8的免疫球蛋白，其特征在于：CH1、CH2和/或CH3的经修饰的环区在第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸或第108-117位氨基酸内包含至少一个修饰。10.权利要求1的免疫球蛋白，其特征在于：所述可变区选自VH、Vκ、Vλ、VHH及其组合。11...

【专利技术属性】
技术研发人员：F鲁克，G希姆勒，G沃兹尼克诺普，
申请(专利权)人：F星生物科技研究和发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT