一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变区片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和(iv)激活域。优选的共刺激结构域是CD28、4‑1BB、ICOS‑1、CD27、OX‑40、GITR或DAP10。

A chimeric antigen receptor T cell carrying repetitive activation motifs in costimulatory domain

【技术实现步骤摘要】
一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞
本专利技术涉及肿瘤的过继免疫基因治疗领域，具体地涉及一种编码嵌合抗原受体的核酸以及表达嵌合抗原受体的细胞。本专利技术特别涉及在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞。
技术介绍
免疫治疗是一种非常有前途的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统有效的武器，它们能够持续性地帮我们区分正常细胞和外来抗原或非正常细胞，如癌症或被感染的细胞。基因修饰的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，这代表了一种有效的免疫治疗方法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以增殖并在患者体内持续存在(“活的药物”)。CAR(嵌合抗原受体)通常是由一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段(scFv)通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域：单个细胞活化的CD3-ζ结构域；以及和CD3-ζ结构域相连的CD28，CD137(4-1BB)或其他共刺激域(也可用CD27信号结构域代替CD28或CD137结构域，图1)。CAR的发展从第一代(没有共刺激域)到第二代(具有一个共刺激域)到第三代CAR(具有多个共刺激域)。生成的具有多个共刺激域的CAR(即所谓的第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。然而，目前嵌合抗原受体的研究还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞。在本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和(iv)激活域。在另一优选例中，所述的肿瘤抗原选自下组：间皮素、VEGFR-2、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetylGD2、O-acetylGD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gpl30、LewisA、LewisY、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol,a、Frizzled、OX40、CD79b、和Notch-1-4。在另一优选例中，所述的肿瘤抗原是间皮素。在另一优选例中，所述的共刺激结构域选自下组：CD28、4-1BB、ICOS-1、CD27、OX-40、GITR和DAP10。在另一优选例中，所述的共刺激结构域是CD28。在另一优选例中，所述的融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序YMNM。在另一优选例中，所述的融合蛋白包含连续重复1、2、3或4次的结合基序PYAP。在另一优选例中，在最后一个YMNM之后立即包含从T到P的突变。在另一优选例中，所述的共刺激结构域的序列如SEQIDNO.:14所示。在另一优选例中，所述的结合基序位于共刺激结构域，较佳地位于共刺激结构域CD28。在另一优选例中，所述的scFv包含VH和VL，并且，所述融合蛋白还包含一Beacon标签，所述Beacon标签连接至VH的N端、或位于VH和VL之间、或位于VL和跨膜结构域之间。在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为权利要求3所述的单链抗体；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激结构域；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:4所示。在另一优选例中，所述的融合蛋白具有间皮素ScFv-Beacon-CD28TM-CD28DD-CD3ζ的氨基酸序列，或者在每个片段中具有至少95％的同一性。在另一优选例中，所述的融合蛋白具有间皮素ScFv-Beacon-CD28TM-CD28DD,T195P-CD3zetaζ的氨基酸序列，或者在每个片段中具有至少95％的同一性。在本专利技术的第二方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQIDNO.:3所示。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第二方面所述的核酸分子。在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。在另一优选例中，所述核酸分子位于慢病毒载体的XbaI和EcoRI慢病毒位点中。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本专利技术第二方面所述的核酸分子或表达本专利技术第一方面所述的CAR。在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述细胞为T细胞。在本专利技术的第五方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本专利技术第一方面所述的CAR，包括以下步骤：将本专利技术第二方面所述的核酸分子或本专利技术第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。在本专利技术的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本专利技术第一方面所述的嵌合抗原受本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N‑末端到C‑末端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和(iv)激活域。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，其具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序，和(iv)激活域。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的肿瘤抗原选自下组：间皮素、VEGFR-2、CD19、CD20、CD30、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3、PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetylGD2、O-acetylGD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gpl30、LewisA、LewisY、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹卫，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31