工程改造免疫球蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及：工程改造免疫球蛋白以及测定所述免疫球蛋白与抗原表位结合的方法、由该方法制备的免疫球蛋白、和免疫球蛋白文库，所述免疫球蛋白包含可变结构域和在该免疫球蛋白的至少两个结构环中的至少一个修饰，其中未修饰的免疫球蛋白明显不与所述表位结合，所述方法包含以下步骤：提供编码包含至少两个结构环的免疫球蛋白的核酸，修饰每个所述结构环的至少一个核苷残基，将所述经修饰的核酸转移到表达系统中，表达所述经修饰的免疫球蛋白，使所表达的修饰免疫球蛋白与表位接触，并且测定所述修饰免疫球蛋白是否与所述表位结合。

Engineering Modification of Immunoglobulin

The present invention relates to engineering modification of immunoglobulin and a method for determining the binding of the immunoglobulin to antigen epitopes, an immunoglobulin library prepared by the method, and an immunoglobulin library comprising a variable domain and at least one modification in at least two structural rings of the immunoglobulin, in which the unmodified immunoglobulin is obviously not said. The method comprises the following steps: providing nucleic acid encoding immunoglobulin containing at least two structural rings, modifying at least one nucleoside residue of each structural ring, transferring the modified nucleic acid to the expression system, expressing the modified immunoglobulin, contacting the expressed modified immunoglobulin with the epitope, and determining the modified immunity. Whether the immunoglobulin binds to the epitope.

【技术实现步骤摘要】
工程改造免疫球蛋白的方法本申请是国际申请日为2007年07月05日、国际申请号为PCT/AT2007/000343、进入国家阶段的申请号为200780032857.X、专利技术名称为“工程改造免疫球蛋白的方法”的PCT申请的分案申请。
本专利技术涉及工程改造和制备包含经修饰的免疫球蛋白可变区多肽的分子的方法。一般领域是工程改造蛋白质以赋予其特异性结合的特性。更具体地讲，这里相关的工程蛋白质是免疫球蛋白(抗体)，甚至更具体地讲，是免疫球蛋白的单个可变结构域(variabledomain)、或单个可变结构域对或组合、或与其它免疫球蛋白结构域的组合。免疫球蛋白的特异性结合特性是重要的特征，因为它们控制着与其它分子如抗原的相互作用，使得免疫球蛋白可用于诊断和治疗的应用。
技术介绍
抗体的结构不同物种和不同类别的抗体的基本结构是相似的，在这里用一个完整IgG1免疫球蛋白的作为例子来解释。两个同样的重(H)链和两个同样的轻(L)链结合形成Y形抗体分子。重链各有四个结构域。氨基末端可变结构域(VH)在Y的顶部。后接有三个恒定区结构域(constantdomain)CH1、CH2和在Y主干的底部的羧基端CH3。一段短的区段：转换区(switch)连接重链可变区和恒定区。铰链将CH2和CH3(Fc片段)连接到抗体(Fab片段)的剩余部分。一个Fc和两个同样的Fab片段可通过蛋白酶切割完整抗体分子的铰链而产生。轻链由被转换区分隔的可变(VL)和恒定(CL)两个结构域组成。铰链区的二硫键连接着两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链连接。重链和轻链的可变区(VL)和(VH)位于Y的“顶部”，它们定位于此与抗原反应。该分子的这个顶部是氨基酸序列N-末端所在的一端。Y的主干表现在某种程度上有效地介导效应功能例如补体活化和与Fc受体相互作用、或ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域凸出以方便与效应蛋白相互作用。氨基酸序列C-末端位于顶部的对边，可称为Y的“底部”。免疫球蛋白可变结构域(V结构域)抗体分子中每个结构域有一个相似的结构：两个β片层在紧缩的反向平行β桶中彼此紧压。该守恒的结构被定义为免疫球蛋白折叠。参考Bork等(1994)J.MoI.Biol.242：309-320；Halaby等(1999)ProteinEngineering12：563-571；Immunobiology.5thed.Janeway，CharlesA.；Travers，Paul；Walport，Mark；Shlomchik，Mark.NewYorkandLondon：GarlandPublishing；2001。可变结构域折叠有9个β股，排列在4股和5股的两个片层中。上述5股的片层与恒定结构域的3股片层结构同源，但是含有额外的股C和股C”。剩余的股(A、B、C、D、E、F、G)与其在恒定结构域免疫球蛋白折叠中的负体有同样的拓扑结构和相似的结构。如在恒定结构域中一样，二硫键连接在相对的片层中的股B和股F。免疫球蛋白轻链和重链的可变结构域都含有三个高变环，即互补决定区(CDR)。V结构域的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)群集在β桶的一端。CDR是连接免疫球蛋白折叠的β链B-C、C’-C”和F-G的环。CDR上的残基随各种免疫球蛋白分子的不同而不同，赋予每种抗体对抗原的特异性。在抗体分子顶部的VL和VH结构域紧压在一起以至6个CDR(每个结构域3个)配合构成特异性结合抗原用的表面(或空腔)。因而抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变结构域的股B-C、股C’-C”和股F-G和重链可变结构域的股B-C、股C’-C”和股F-G的环组成。用于蛋白质工程的支架利用蛋白质3D结构作为设计的辅助，用蛋白质的核心结构作为支架，使位于许多蛋白质表面的氨基酸残基随机化。以下参考文献中描述或综述了该策略的实例，以引用的方式并入本文：NygrenPA，UhlenM.，CurrOpinStructBiol.(1997)7：463-9；BinzHK，AmstutzP，KohlA，StumppMT，BriandC，ForrerP，GrutterMG，PluckthunA.NatBiotechnol.(2004)22：575-82；VogtM，SkerraA.Chembiochem.(2004)5：191-9；US6,562,617；Hufton等FEBSLetters(2000)475：225；Binz等NatBiotechnol.(2005)23：1257-68；Hosse等ProteinSci.(2006)15：14-27。该技术的基本原理是基于对许多蛋白质具有稳定核心的观察，该核心通过如β片层或α螺旋的二级结构元件的特定排列而形成，而二级结构元件通过环、转角或无规卷曲结构相互连接。通常，后面这三种结构元件对于蛋白质整体结构的重要性较小，在这些结构元素中的氨基酸残基可被交换而常常不会破坏总的蛋白质折叠。这一设计原理的天然例子是如可在抗体、T-细胞受体和其它免疫球蛋白超家族分子中发现的免疫球蛋白样结构域的CDR。免疫球蛋白可变结构域CDR环的操作很多现有技术文献显示免疫球蛋白样支架被用于对现有的抗原或配体结合位点进行操作以引入新的结合特性的目的。更确切地讲，主要是对CDR区进行抗原结合工程改造，换言之对于免疫球蛋白折叠而言，修饰天然抗原结合位点以改变其结合亲和力或特异性。现有大量文献描述这些被操纵的免疫球蛋白的不同形式，通常以完全抗体、融合产物和/或片段如单链Fv片段(scFv)、双抗体、微型抗体、单结构域或Fab片段等等的形式表达，或者在噬菌体颗粒或其它病毒和细胞表面展示，或者在各种原核或真核表达系统中可溶性表达。这些技术例如在Holliger&Hudson.，，Nat.Biotechnol.(2005)23：1126-36和Hoogenboom，Nat.Biotechnol.(2005)23：1105-16中综述。免疫球蛋白可变结构域的骨架或非CDR区免疫球蛋白可变结构域的CDR环决定抗原特异性。分子的剩余部分叫做骨架(FR)。然而这些骨架区由β股和环结构组成。天然免疫球蛋白可变结构域中的非CDR环的环没有抗原结合或表位结合特异性，但是有助于免疫球蛋白结构域的正确的总体折叠因，此也有助于CDR的正确定位和结构域之间的相互作用。为了本专利技术的意图，将这些环称为结构环。通常出于很多不同的原因对抗体可变结构域进行操作，例如各种抗体形式(format)的构建、CDR移植(也就是将特定抗体的特异性移植到另一个骨架；例如Jones等Nature(1986)321：522-525；Kashmiri等Methods(2005)36∶25-34)、改变可变结构域的表面以使其更具可溶性和稳定性(例如Ewert等Methods(2004)34：184-99；Conrath等JMoIBiol.(2005)350：112-125)、使其变为单体(例如Dottorini等Biochemistry(2004)43：622-628))或研究可变结构域之间的相互作用(例如Masuda等FEBSJ.(2006)273：2184-94)。很多那些操作已经包括了改变分子骨架区；已经完成了一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，用于工程改造免疫球蛋白并测定所述免疫球蛋白与抗原表位的结合，所述免疫球蛋白包括可变结构域和所述免疫球蛋白的至少两个结构环中的至少一个修饰，其中未修饰的免疫球蛋白明显不与所述表位结合；所述方法包含以下步骤：‑提供编码包含至少两个结构环的免疫球蛋白的核酸，‑修饰所述结构环的每一个的至少一个核苷酸残基，‑将所述修饰的核酸转移到表达系统中，‑表达所述修饰的免疫球蛋白，‑使所表达的修饰的免疫球蛋白与表位接触，并且‑确定所述修饰的免疫球蛋白是否与所述表位结合。

【技术特征摘要】
2006.07.05 AT A1145/20061.一种方法，用于工程改造免疫球蛋白并测定所述免疫球蛋白与抗原表位的结合，所述免疫球蛋白包括可变结构域和所述免疫球蛋白的至少两个结构环中的至少一个修饰，其中未修饰的免疫球蛋白明显不与所述表位结合；所述方法包含以下步骤：-提供编码包含至少两个结构环的免疫球蛋白的核酸，-修饰所述结构环的每一个的至少一个核苷酸残基，-将所述修饰的核酸转移到表达系统中，-表达所述修饰的免疫球蛋白，-使所表达的修饰的免疫球蛋白与表位接触，并且-确定所述修饰的免疫球蛋白是否与所述表位结合。2.权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白与至少两个不同的表位特异性结合。3.免疫球蛋白用于制备免疫球蛋白文库的用途，所述免疫球蛋白通过权利要求1-2中任一项的方法可得到。4.包含至少10个免疫球蛋白的文库，所述免疫球蛋白通过权利要求1-2中任一项的方法可得到且在至少两个结构环上具有修饰。5.根据权利要求1-2中任一项的方法可得到的修饰的免疫球蛋白，其具有通过结构环上至少两个修饰而对抗原特异的结合位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：G希姆勒，G雷德尔，F鲁克，
申请(专利权)人：F星生物科技研究和发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT