一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用制造技术

本申请公开了一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。本申请的试剂盒包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。本申请的试剂盒，灵敏度高、特异性强能有效提升血尿病人膀胱癌的检出率、提升早期发现率，提升病人5年生存率。采用本申请的试剂盒进行膀胱癌辅助筛查，以尿液为检测样本，取样方便，属于无创检测，能提升受检者的接受程度，有利于扩大膀胱癌筛查的覆盖人群，降低中国膀胱癌发生率，为全民健康提供保障。更为重要的是，采用本申请试剂盒进行筛查，可以有效避免阴性患者因行膀胱镜带来的尿路感染、尿路损伤等风险，提高患者的依从性，从而改善就医体验与医患关系。

A Kit for Assisted Diagnosis or Screening of Bladder Cancer and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用
本申请涉及膀胱癌基因检测领域，特别是涉及一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。
技术介绍
膀胱癌是泌尿液系统最常见的恶性肿瘤，占我国泌尿液生殖系肿瘤发病率的第一位。2015年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病数约为8.03万，恶性肿瘤死亡数约为3.29万，发病率和死亡率随年龄增长而增加。血尿液是膀胱癌最常见的症状，研究发现12％的血尿病人经检查发现是膀胱癌。目前临床应用的血尿检查一般有尿常规、B超、尿液脱落细胞学检查和膀胱内窥镜检查等。膀胱内窥镜检查被视为膀胱癌诊断的金标准，但膀胱镜检查可能导致如尿路感染、尿道损伤、膀胱损伤等负面影响。普通膀胱镜检通常令患者十分痛苦，患者依从性差；而无痛膀胱镜检查仍然会有麻醉风险，且收费较高，也无法避免尿路感染等负面影响的风险。超声检查虽然不会有膀胱内窥镜检查的负面作用，但是其灵敏度只有60-75％，特异度只有40-85％，无法准确筛查出癌症患者。因此，无创的尿液标志物检测可作为膀胱癌辅助诊断或筛查非常好的参考方法。目前，无创的膀胱癌尿液标志物检测主要包括尿液脱落细胞学检查、荧光原位杂交技术和尿液蛋白检测。尿液脱落细胞学检查具有无创伤、特异性高、非侵入性的优点，但是其敏感性为13％-75％，特异性为85％-100％，且受多种因素影响。荧光原位杂交(FISH)技术也是一种尿液无创检测方法，检测3号、7号、17号染色体以及9号染色体的变异情况来辅助诊断膀胱肿瘤，有助于术后监测及评估复发危险性。目前膀胱癌诊断临床应用的FISH技术灵敏度达到90.78％，然而特异性较低，只有82.35％，其特异性与脱落细胞学检查没有统计学差异。无创的尿液蛋白检测，例如膀胱肿瘤抗原(Bladdertumorantigen,BTA)检测，采用化学发光法定量检测尿液中的BTA，灵敏度只有76.7％，特异度90.9％。另一种无创的尿液蛋白检测，尿核基质蛋白22(Nuclearmatrixprotein22,NMP22)检测，北大吴阶平泌尿外科多中心临床试验证明胶体金法检测NMP22，其敏感性也只有69.6％，特异性84.9。美国FDA已经批准BTAStat、BTA、Trak、NMP22、ImmunoCyt和FISH用于膀胱癌的诊断和术后随诊检查，其中ImmunoCyt是一种免疫细胞学检查。上述方法除FISH以外均已应用多年，总的来看，仍存在敏感性和特异性不足的问题。因此，有必要寻求一种新的灵敏度更高、特异性更强的无创的膀胱癌肿瘤检测方案。高通量测序推动了基因测序行业发展，同时也极大地拓展了基因检测在精准医疗领域的应用。肿瘤液体活检由于其在检测肿瘤、辅助治疗方面的明显优势，被列为2015年十大突破技术之一，检测对象包括CTC、cfDNA、外泌体等。其中，cfDNA即游离DNA(Cell-freeDNA，cfDNA)，又称循环DNA，是存在于血液、尿液中游离于细胞外的DNA。cfDNA中来自肿瘤基因组的游离DNA片段，称为ctDNA；ctDNA与肿瘤细胞本身的DNA特点存在一致性，能够反映肿瘤的特征性改变。通过检测体液中的游离DNA的变异，例如突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等，可反映肿瘤组织的克隆特点，作为判断肿瘤良恶性，肿瘤疗效观测，复发监测的有效手段。cfDNA作为一种新型的诊断标志物，其应用价值在多种实体肿瘤中得以证实。cfDNA的无创性和易获得性，是液体活检的重要方式，被认为可以用于检测肿瘤早期诊断，进展过程，预后判断及个性化用药指导，是精准医疗的必备手段。癌症早期患者的cfDNA便释放进体液，在影像学观察不到病灶的情况下，检测到cfDNA的肿瘤相关突变，可提示癌症早期风险。或者在患者没有出现晚期症状的情况下指导受检者进行进一步的临床检查，从而筛查出早期肿瘤患者，提高肿瘤的生存率以及治愈率。有统计数据表明膀胱癌的早期治愈率较高，关键在于早期病人的筛查。cfDNA突变检测相对于FISH检测以及蛋白标志物检测，其灵敏度、特异性更高，且受干扰因素较少，检测结果的准确性更高。但是，目前尚未有关于膀胱癌的cfDNA突变检测方案或相关研究报道；因此，研发膀胱癌的cfDNA突变检测，对膀胱癌的早期筛查或预后具有重要意义。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。需要说明的是，本申请以膀胱镜检查正常为阴性，膀胱镜检查检出异常并通过病理检测验证为癌症患者为阳性，作为本申请检测的金标准对照；对55例样本的24个基因进行高通量测序分析，根据55例样本基因是否发生突变以及样本的真实阴阳性建立逻辑斯特回归模型；并利用该模型对样本进行随机抽取样本验证，分析多个基因叠加的AUC变化趋势，发现在4个基因的时候达到稳定，后面的基因突变对AUC提升影响不大。本申请的一种实现方式中，具体是PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因，可以达到灵敏度0.871，特异性为1。因此，本申请特别提出以PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因的突变情况作为膀胱癌辅助诊断或筛查的依据，并提出这四个基因突变情况检查的高通量测序引物组合，作为膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒。可以理解，采用本申请的试剂盒对膀胱癌进行诊断或筛查，其灵敏度可达87.1％，特异性可以达到100％，能够准确而特异性的对膀胱癌进行检测。优选的，引物组合包括检测PTEN的第一引物对，检测BRAF的第二引物对，检测PIK3CA的第三引物对和检测FGFR2的第四引物对；第一引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列，第二引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所示序列，第三引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.5和SeqIDNo.6所示序列，第四引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.7和SeqIDNo.8所示序列。需要说明的是，SeqIDNo.1至SeqIDNo.8所示序列的四个引物对组合只是本申请的一种实现方式中具体的能够有效的对PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因进行扩增，并实现四个基因的高通量测序突变检测的引物序列，不排除还可以采用其它引物实现相同的功能。并且，在本申请的一种实现方式中，四个引物对，其上游引物或者下游引物可以组合在一起使用，实现四个靶标的多重扩增和检测，提高了检测效率。优选的，本申请的试剂盒还包括用于高通量测序检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR中的至少一种基因的引物对。需要说明的是，虽然本申请已经验证，在4个基因的时候达到稳定，后面的基因突变对AUC提升影响不大，也就是说，再增加检测基因的个数并不会提高检测的灵敏度和特异性；但是，为了更为全面而准确的了解膀胱癌基因突变情况，还可根据需求对其他的基因进行检测，例如TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，其特征在于：包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。

【技术特征摘要】
1.一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒，其特征在于：包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物组合包括检测PTEN的第一引物对，检测BRAF的第二引物对，检测PIK3CA的第三引物对和检测FGFR2的第四引物对；所述第一引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列，所述第二引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所示序列，所述第三引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.5和SeqIDNo.6所示序列，所述第四引物对的上下游引物分别为SeqIDNo.7和SeqIDNo.8所示序列。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：还包括用于高通量测序检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR中的至少一种基因的引物对。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：检测TP53、ERBB2、HRAS、AKT1、KRAS、TERT、CTNNB1、ACTB、APC、ARID1A、NRAS和mTOR的引物对的上下游引物依序分别为SeqIDNo.9至SeqIDNo.32所示序列。5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：还包括对样品DNA进行加接头处理的接头，以及与接头匹配的通用引物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述接头为TruSeq接头。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述通用引物为P5、P7和UniverseF，Un...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴应，宋卓，何庆，王永利，杨婷，高堂杰，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43