靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用；基于CRISPR/Cas9，设计针对鸡IRF7基因的gRNA靶序列并连接至VK001‑02质粒，获得鸡IRF7基因打靶载体；利用脂质体将打靶载体转染至鸡成纤维细胞中。通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞后，经有限倍比稀释法筛选获得敲除chIRF7基因的鸡成纤维细胞。该敲除细胞系经TCID50验证表明其可使病毒滴度增高。该方法适用于鸡天然免疫模式识别受体所介导的干扰素表达通路中重要转录因子IRF7的作用及功能的研究。同时本发明专利技术所构建的敲除细胞系可使许多先天免疫通路所介导的干扰素β表达水平下调，利于病毒繁殖，可用于疫苗制备中病毒的扩增。

Targeted knockout of chicken IRF7 gene and its application in vaccine preparation

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9是广泛存在于细菌和古生菌中的天然免疫系统。该系统的基本结构包括tracrRNA序列区、cas基因序列区和CRISPR序列区。当噬菌体首次侵入宿主时，cas基因锁编码的蛋白复合物会裂解噬菌体DNA上的端间隔序列，随后将裂解片段整合到自身DNA的CRISPR5’端。当噬菌体再次侵入宿主时，CRISPR序列区转录出pre-crRNA，并在RNaseⅢ、cas9及tracrRNA的共同作用下成熟为crRNA。crRNA与tracrRNA形成复合体，与噬菌体DNA特异位点互补配对结合，引导cas9核酸酶对结合位点进行切割。为了便于应用，在实际操作中常将crRNA与tracrRNA改造成gRNA。故只需设计一段与目标DNA序列互补的gRNA序列，将该gRNA与编码cas9核酸酶的mRNA导入细胞，即可实现对目标DNA的切割。切割完成后，引发非同源性末端结合或同源重组使断裂DNA重新连接。在此修复过程中会发生部分碱基的缺失或插入从而造成移码突变，从而实现特定基因的敲除。CRISPR/Cas9已被用于多种模式动物的基因敲除，然而该技术在禽类基因敲除上的应用仍较少，且已有的在禽类上的应用报道较低的敲除效率。本专利技术提供了一个高效的鸡CRISPR/Cas9基因敲除方法，用于敲除鸡IRF7基因效率较高。同时，本专利技术通过TCID50表明本专利技术所构建的鸡IRF7基因敲除细胞感染病毒后较野生型细胞病毒滴度更高，即相较于现有工具，本专利技术提供了一个更高效的病毒扩增工具，可用于包括但不限于疫苗制备中的病毒扩增。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，用于但不限于鸡成纤维细胞(DF-1)。本专利技术的另一目的是在于，提供利用上述方法制备的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系及其作为细胞模型在IRF7在先天免疫信号转导通路中的功能研究的应用。本专利技术的又一目的是在于，提供可用于包括但不限于在疫苗制备中病毒扩增的更高效工具。本专利技术根据CRISPR/Cas9系统原理及gRNA设计原理，利用靶标设计软件设计出两对针对鸡IRF7的gRNA，构建基因CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因打靶载体。gRNA作用位点的DNA序列分别为：AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGGSEQIDNO.2；和AAGGGATGCGGAAGATACGGCGGSEQIDNO.3；用于构建所述表达载体的出发载体为VK001-02。本专利技术的目的具体是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据CRISPR/Cas9设计原则，设计针对鸡IRF7基因的gRNA序列；(2)构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因的打靶载体；(3)将打靶载体转染细胞；(4)筛选稳定细胞株；(5)测定打靶效率；(6)筛选阳性克隆株，获得鸡IRF7基因敲除细胞系。优选的，所述gRNA序列为：IRF7-gRNA1:AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGGSEQIDNO.2；IRF7-gRNA2：AAGGGATGCGGAAGATACGGCGGSEQIDNO.3。优选的，所述打靶载体的出发载体是VK001-02。优选的，转染的细胞是鸡成纤维细胞DF-1。优选的，所述筛选稳定细胞株的方法是使用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。优选的，所述测定打靶效率为取细胞悬液测序获得打靶效率。具体为：取细胞悬液，进行PCR扩增测序分析。优选的，用于测定打靶效率的特异性PCR引物为：CRISPR-IRF7-G200U(g2+g1)TGCCGCCCCGCAGGGACGCCCAGSEQIDNO.8；CRISPR-IRF7-G1100L(g2+g1)GGTCCGGGCTCACCTGAGGCAACCSEQIDNO.9；CRISPR-IRF7-G600L(g2)TCCCACAGAACCATTAAGGCTGGAASEQIDNO.10；CRISPR-IRF7-G500U(g1)GGGCACTGGTGAGATCGCTGTGCSEQIDNO.11。优选的，所述筛选阳性克隆株即鉴定中靶阳性细胞克隆。具体为对稀释所得各单克隆进行PCR扩增测序比对分析。优选的，用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物为：CRISPR-IRF7-G200U(g2+g1)TGCCGCCCCGCAGGGACGCCCAGSEQIDNO.8；CRISPR-IRF7-G600L(g2)TCCCACAGAACCATTAAGGCTGGAASEQIDNO.10。第二方面，本专利技术涉及一种鸡IRF7基因的打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，所述gRNA表达载体的出发载体为VK001-02质粒；所述gRNA序列为：IRF7-gRNA1:AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGGSEQIDNO.2；或IRF7-gRNA2：AAGGGATGCGGAAGATACGGCGGSEQIDNO.3。优选的，所述gRNA表达载体的出发载体为VK001-02质粒。优选的，所述打靶载体是根据gRNA序列，人工合成反向互补的寡核苷酸，将互补的寡核苷酸变性退火后与质粒VK001-02连接构建得到的。所述gRNA表达载体为CRISPR-chIRF7-g1或CRISPR-chIRF7-g2。第三方面，本专利技术还涉及一种鸡IRF7基因的打靶载体在制备鸡IRF7基因敲除细胞系中的应用。第四方面，本专利技术还涉及一种鸡IRF7基因敲除DF-1细胞系，用前述的打靶载体转染鸡成纤维细胞(DF-1)，获得的中靶阳性细胞克隆，即为鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系。优选的，利用脂质体将打靶载体转染至鸡成纤维细胞(DF-1)。优选的，使用本专利技术构建的鸡IRF7基因敲除DF-1细胞系，突变后的IRF7基因对应的DNA序列如下SEQIDNO.13所示：突变型：GAAGA—CGGCGGTSEQIDNO.12；野生型：GAAGATACGGCGGTSEQIDNO.13。可见，使用本专利技术构建的细胞模型鸡IRF7敲除的DF-1细胞系，缺失了IRF7基因序列，而对上下游基因序列并未产生突变。第五方面，本专利技术还涉及一种前述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系及其作为细胞模型在IRF7在先天免疫信号转导通路中的功能研究的应用。第六方面，本专利技术还涉及一种前述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系在包括但不限于疫苗制备中病毒扩增的应用。本专利技术通过双荧光报告基因实验表明本专利技术所构建的鸡IRF7敲除的DF-1细胞系相较于DF-1细胞可使先天免疫信号通路所介导的干扰素β表达水平下调；通过TCID50表明，鸡IRF7敲除的DF-1细胞系相较于DF-1细胞病毒滴度更高，故可应用于更高效的病毒扩增。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术通过CRISPR/Cas9技术首次敲除掉鸡成纤维细胞(DF-1)的IRF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、根据CRISPR/Cas9设计原则，设计针对鸡IRF7基因的gRNA序列；S2、构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因的打靶载体；S3、将打靶载体转染细胞；S4、筛选稳定细胞株；S5、测定打靶效率；S6、筛选阳性克隆株，获得鸡IRF7基因敲除细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、根据CRISPR/Cas9设计原则，设计针对鸡IRF7基因的gRNA序列；S2、构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因的打靶载体；S3、将打靶载体转染细胞；S4、筛选稳定细胞株；S5、测定打靶效率；S6、筛选阳性克隆株，获得鸡IRF7基因敲除细胞系。2.如权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，其特征在于，所述gRNA序列为如SEQIDNO.2所示的序列或如SEQIDNO.3所示的序列；打靶载体的出发载体是VK001-02；转染的细胞是鸡成纤维细胞DF-1。3.如权利要求1所述测定打靶效率的方法，其特征在于，用于测定打靶效率的特异性PCR引物分别为如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9所示序列的引物对，如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示序列的引物对。4.如权利要求1所述的敲除鸡IRF7基因的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，程玉强，伦敏翔，严亚贤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31