一种调控PCV2病毒增殖的序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种调控PCV2病毒增殖的gRNAs序列。本发明专利技术设计了与PCV2复制相关的8个gRNA靶向片段：gRNA‑Oc8，gRNA‑O13，gRNA‑O134，gRNA‑O26，gRNA‑NPS，gRNA‑NQT和gRNA‑NAT，分别靶向PCV2复制起点的八聚体结构、ORF1和ORF3的重叠区、ORF1，ORF3和ORF4的重叠区、ORF2和ORF6的重叠区、ORF1的23‑25aa糖基化位点、ORF1的256‑258aa糖基化位点及ORF1的286‑288aa糖基化位点。以pX458为表达载体，获得PCV2 Cas9/gRNAs重组质粒，并对阳性Cas9/gRNAs克隆进行了测序鉴定。同时，成功得到以PCV2 Cas9/gRNAs重组质粒转染的PK‑15细胞系，且PCV2 Cas9/gRNAs重组质粒能对PCV2基因组进行有效编辑，并抑制PCV2在PK‑15细胞内的增殖复制。

A Sequence Regulating PCV2 Virus Proliferation and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种调控PCV2病毒增殖的序列及其应用
本专利技术属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种调控PCV2病毒增殖的序列。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统通过gRNA(tracrRNA+crRNA)与靶DNAPAM序列特异性识别，引发Cas9核酸酶定点切割互补双链DNA，在基因剪辑方面具有制备简单、剪辑位点特异性高及易于同时剪辑多个基因位点等优势，已被广泛应用于哺乳动物细胞基因剪辑。目前，CRISPR/Cas9已成功应用于小鼠、斑马鱼和人类细胞甚至细菌的基因组精确编辑。CRISPR/Cas9对病毒基因组的编辑相继也有报道，已成功应用CRISPR/Cas9技术对双链DNA病毒和单链RNA病毒进行了有效编辑。目前尚未有应用CRISPR/Cas9技术对单链DNA病毒进行编辑的报道。猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是目前已知的侵染哺乳动物的最小病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜的单股环状DNA病毒。猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)是猪圆环病毒的两个主要基因型。PCV1是从猪肾上皮细胞PK-15中分离出来的非致病性病毒粒子，PCV2发现于1998年，是造成猪圆环病毒相关病(Porcinecircovirus-associateddisease，PCVAD)的主要病原体。PCVAD起初被描述为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)。随着越来越多与PCV2感染相关的临床症状(诸如繁殖障碍、肠道疾病及呼吸症状)的出现，才将这种疾病改命名为猪圆环病毒相关病(美国)和猪圆环病毒病(欧洲)。作为一种大约只有1.7kb大小的单链环状DNA病毒，PCV2的复制很大程度上依赖于宿主细胞的运转。因此，在病毒复制的过程中，PCV2通过与多种宿主细胞因子的相互作用来调节宿主免疫功能，从而导致细胞因子失衡，免疫抑制乃至疾病。PCV2基因组DNA有11个潜在开放阅读框。间隔区IR含有与复制起点相关的茎环结构。由于PCV2极小的基因组限制了其编码能力，因此PCV2的生命周期很大程度上取决于其自身的复制能力。形态学上，PCVs粒子直径大约为15-20nm，无囊膜，二十面体对称的衣壳蛋白包裹整个基因组。PCVs的病毒粒子是包含60个衣壳蛋白拷贝的结构。PCV1和PCV2基因组内含11个潜在ORFs。在这些ORFs里，ORF1和ORF2是两个主要的ORFs，并沿着相反的方向编码，这样的编码方式就衍生出一个双义基因组结构和2个基因间区域(IR)。其中，ORF1和ORF2基因的3’末端之间的IR是比较短的基因间区域，而它们的5’端之间的IR是较长的基因间区域，该区域内包含着PCV2复制的起点位置。PCV2复制起始于一个假定的茎环结构(Stem-Loop，SL)，并以滚环复制模式进行复制。ORF1和ORF2之间间隔区内假定的茎环结构(Stem-Loop)和3个六核苷酸重复序列(H1，H2，H3：CGGCAG)与DNA复制起始有关。茎环结构为反向重复序列，环区包含了10个核苷酸，含有保守的八聚体(Oc8：A1x2T3A4x5T6↓A7C8；箭头代表DNA复制时的切开位点)。ORF1编码复制蛋白Rep，ORF2编码衣壳蛋白Cap，ORF3编码非结构蛋白由。PCV2的Rep蛋白大小为35.8kDa(314aa)，由ORF1全长编码。含有3个糖基化位点，23-25aa(NPS)；256-258aa(NQT)和286-288aa(NAT)。为了间接控制管理PCVAD，PCV2的复制性研究至关重要。降低PCV2病毒增殖的序列可以用于防治管理PCVAD的传播或者发生、发展。
技术实现思路
针对缺乏猪圆环病毒2型调控序列的问题，本专利技术提供一种调控PCV2病毒增殖的序列，可以有效调控PCV2的增殖。为实现上述目的，本专利技术以CRISPR/Cas9系统原理及其gRNA的设计原理为基础，以pX458为表达载体，获得PCV2Cas9/gRNAs重组质粒，并对阳性Cas9/gRNAs克隆进行了测序鉴定。本专利技术采用如下技术方案。一种调控猪圆环病毒2型(PCV2)病毒复制的gRNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1-7任一所示。所述调控为抑制调控。所述gRNA序列，SEQIDNO:1靶向PCV2复制起点的八聚体结构，碱基序列简称为gRNA-Oc8。SEQIDNO:2靶向ORF1，ORF3和ORF4的重叠区，碱基序列简称为gRNA-O134。SEQIDNO:3靶向ORF1和ORF3的重叠区，碱基序列简称为gRNA-O13。SEQIDNO:4靶向ORF2和ORF6的重叠区，碱基序列简称为gRNA-O26。SEQIDNO:5靶向ORF1编码23-25aa的糖基化位点NPS，碱基序列简称为gRNA-NPS。SEQIDNO:6靶向ORF1编码256-258aa的糖基化位点NQT，碱基序列为gRNA-NQT。SEQIDNO.7靶向ORF1编码286-288aa的糖基化位点NAT，碱基序列简称为gRNA-NAT。上述gRNA序列对应的PAM序列依次为：CGG、TGG、TGG、GGG、AGG、AGG、CGG。一种含上述gRNA的PCV2Cas9/gRNAs重组质粒。一种上述PCV2Cas9/gRNA重组质粒转染的细胞系。所述转染过程为：重组Cas9/gRNAs转染细胞的同时，用等量的PCV2-SD病毒进行感染。一种上述gRNA、重组质粒和转染细胞系在制备治疗和预防猪圆环病毒2型病毒引起病症药物中的用途。本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的调控猪圆环病毒2型(PCV2)病毒复制的gRNAs序列gRNA-Oc8，gRNA-O13，gRNA-O134，gRNA-O26，gRNA-NPS，gRNA-NQT和gRNA-NAT，分别靶向PCV2复制起点的八聚体结构、ORF1和ORF3的重叠区、ORF1，ORF3和ORF4的重叠区、ORF2和ORF6的重叠区、ORF1编码23-25aa的糖基化位点NPS、ORF1编码256-258aa的糖基化位点NQT及ORF1编码286-288aa的糖基化位点NAT。通过构建的重组Cas9/gRNAs，能对PCV2基因组进行有效编辑并抑制PCV2在PK-15细胞内的增殖复制。附图说明图1为gRNAs序列在PCV2基因组中的靶位点；图2为gRNAs序列特异性比对；图3为体外酶切电泳结果。M是DL-2000DNAMarker；NC1是未经Cas9酶切的转录产物；NC2是经Cas9酶切的未转录产物；g1是经Cas9酶切的标准gRNA1；g2是经Cas9酶切的标准gRNA2；gRNA-Oc8、gRNA-H3、gRNA-O13、gRNA-O134、gRNA-O26、gRNA-NPS、gRNA-NQT和gRNA-NAT是经Cas9酶切的gRNAs；图4为不同重组Cas9/gRNAs感染PK-15细胞48h后肉眼可见的细胞增殖情况；图5为重组Cas9/gRNAs的蛋白表达结果。M是蛋白Marker；Oc8是重组PCV2Cas9/gRNA-Oc8；O134是重组PCV2Cas9/gRNA-O134；O13是重组PCV2Cas9/gRNA-O13；H3是重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控猪圆环病毒2型病毒复制的gRNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO: 1‑7任一所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控猪圆环病毒2型病毒复制的gRNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1-7任一所示。2.一种如权利要求1所述的gRNA的对应的PAM序列，其特征在于，SEQIDNO:1-7依次对应的PAM序列为：CGG、TGG、TGG、GGG、AGG、AGG、CGG。3.一种含权利要求1所述gRNA的PCV2Cas9/gRNAs重组质粒。4.一种权利要求2所述的PCV2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，时建立，彭喆，吴晓燕，郑书轩，徐绍建，刘畅，韩红，王硕，孙盼盼，王妍，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37