用作疫苗的表达外泌体锚定蛋白的核苷酸序列制造技术

本发明专利技术涉及用作疫苗的表达融合蛋白的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的DNA表达载体，所述融合蛋白包含在C‑末端与抗原融合的外泌体锚定蛋白、或由其组成。

Nucleotide Sequences of Exosome-anchored Proteins Expressed as Vaccines

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用作疫苗的表达外泌体锚定蛋白的核苷酸序列
本专利技术涉及用作疫苗的表达外泌体(exosome)锚定蛋白的核苷酸序列。特别地，本专利技术涉及用作疫苗的表达融合蛋白的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的DNA表达载体，所述融合蛋白包含在C-末端与抗原融合的外泌体锚定蛋白、或由其组成。
技术介绍
已知免疫反应可以提供对外部和内部健康威胁的保护。在许多情况下，当天然免疫不能抑制病理的发展时，通过接种免疫原引起的免疫反应可以阻断病理过程，例如通过诱导针对几种感染性病原体的中和抗体来进行。不同的是，基于CTL的疫苗的鉴定、生产和销售受到更多限制，尽管普遍认为其对于对抗慢性感染和肿瘤疾病的发展具有潜在的用途。引发强烈和广泛的CTL免疫反应预期对于几种病症的治疗具有治疗意义。例如，几个证据表明，细胞介导的免疫反应在控制HPV感染并且因此在控制病毒相关的瘤形成中起着重要作用。事实上，无论是一般的免疫抑制还是不良的抗HPVCTL反应，都与病毒持续性和疾病进展相关。用于诱导抗原特异性CTL免疫的最常用的实验技术是基于病毒载体、肽和灭活病原体的使用。然而，迄今为止，市场上还没有CTL免疫原性药物。用于产生免疫原性蛋白的DNA疫苗接种认为是成功的。例如，一种针对日本脑炎的DNA疫苗已于2010年发布供人类使用(1)。此外，已批准用于保护马免于西尼罗河病毒影响的兽用DNA疫苗(2，3)。此外，据报道，针对多发性硬化的DNA疫苗接种的初步研究是有效的(4)。总而言之，这些证据支持这样的观点，即原则上，DNA疫苗接种可以具有在人类中应用的前景。在DNA疫苗接种的优点中，应该提到的是研发和生产的简易性、储存稳定性、成本效益和免疫原的持久性。理论上的缺点表现为可能产生抗DNA抗体，以及对细胞生长的遗传控制的机制的干扰。然而，主要的限制表现为诱发免疫反应的效力不足。出于这个原因，许多疫苗接种方案(包括为了引发免疫反应使用DNA)继之在替代配方的免疫原接种以增强免疫。外泌体是所有细胞类型组成性地释放的50-100纳米的囊泡。它们由内体膜的向内内陷产生。这些管腔内的囊泡形成可以运输至质膜的多泡体(VB)，它们与质膜融合，从而释放它们的囊泡内容物至胞外环境中。已经在肌细胞中描述了显示出类似于外泌体的物理和生物化学特征，但是通过质膜的直接挤出产生的纳米囊泡(5，6)。尽管之前认为外泌体专门用于分泌废细胞材料，但现在已经认识到外泌体是细胞间通信网络的部分。它们包括了可在靶细胞中起作用的信使RNA、微RNA、DNA和蛋白质。它们的免疫原性基本上是它们并入的抗原的数量和质量的结果。外泌体作为抗肿瘤免疫刺激剂进行了研究，并且在一些情况下它们获得了临床试验的批准(7-9)。自发地上载肿瘤抗原(主要是跨膜蛋白，如gp100、TRP-1、Her2/neu和CEA)的外泌体已经发现诱导特异性抗肿瘤T细胞免疫的激活(10，11)。临床试验证明了外泌体在肿瘤患者中作为无细胞疫苗的可行性和良好耐受性。然而，它们的治疗效果似乎非常有限，因此需要新的方法来提高其免疫原性。这个问题通过工程化外来抗原以增加它们在外泌体膜上的展示来解决。在这个方面，到目前为止已经描述了两种策略。第一种策略是利用乳粘素的C1C2结构域与外泌体脂质的结合，导致异源抗原与外泌体膜的外侧结合。另一种策略依赖于用具有高度疏水的跨膜结构域尾的金黄色葡萄球菌肠毒素A包被外泌体为。HIV的出芽需要与也涉及外泌体生物发生的多种细胞因子(即Alix、Tsg101)及运输所需内体分选复合物(ESCRT)的几种其他组分的相互作用。HIV的包膜和外泌体也共有许多组分，包括脂筏，即富含胆固醇、具有饱和侧链的磷脂和鞘脂的细胞膜微结构域。外泌体和HIV生物发生的趋同意味着病毒产物掺入外泌体中的可能性。HIV-1Nef正是这样的情况，其在MVB的有限膜处通过将其N-末端豆蔻酰化锚定至脂筏微结构域而结合。Nef是缺乏酶活性的27千道尔顿(kDa)蛋白，但在触发信号转导分子的激活时充当支架/衔接体元件，在大多数情况下在与脂筏微结构域结合时。先前已经鉴定了HIV-1颗粒、基于HIV-1的病毒样颗粒(VLP)(12)和外泌体(13)中以相当高的水平包括的V153LE177GNef突变体。当该突变体通过G3C突变用N-末端棕榈酰化进行工程化时，外泌体掺入的效率仍然增加，预期这是与脂筏的结合提高的结果。这种Nef突变体(称为Nefmut)基本上对于所有Nef功能是有缺陷的，并且在其C-末端与外来蛋白融合时，其掺入纳米囊泡中的效率不会显著改变。操纵Nefmut允许将大量选择的抗原掺入外泌体中，其因此保持保护以免受外部中和/降解因素的影响。最近报道，体外产生的Nefmut-工程化外泌体诱导了有效的抗原特异性CTL反应(14)。特别是，使用携带HPV-E7蛋白的体外产生的外泌体作为免疫原已经获得了非常有前景的结果(14)。然而，鉴于这些发现的潜在临床应用，该策略将面临可能的技术困难，包括工业制造的标准化、高成本效益和免疫原的储存。此外，预期体外产生的外泌体在注射时具有有限的半衰期，也通过与外泌体膜结合的“非自身”分子的识别易于从宿主的网状内皮系统中清除。关于这个问题，已经证明了离体分离或体外产生的外泌体的半衰期在注射后持续约2分钟，显示出在肝脏和脾脏中迅速积累，并且在4小时后仅检测到少量的外泌体。因此鉴于上述情况，显然需要提供能够克服已知疗法的缺点的新免疫疗法。
技术实现思路
在这个技术背景下，本专利技术提供了一种基于内源性工程化外泌体产生的新疫苗策略，其能够克服已知的诱导CTL免疫反应以治疗传染病和肿瘤疾病的治疗策略的缺点。根据本专利技术，已经发现通过肌内(i.m.)接种将表达基于Nefmut的融合蛋白的DNA载体施用于宿主动物中引发了有效的CTL免疫反应，所述免疫应答强烈抑制已经植入的肿瘤细胞的生长。几个证据表明内源工程化外泌体的产生是观察到的抗肿瘤作用的基础。特别地，根据本专利技术的结果显示：i)肌细胞在DNA转染后产生工程化外泌体的能力；ii)在接种表达Nefmut/E7的载体后抗原特异性CTL免疫的可重复诱导，其在治疗环境中显示出强烈的抗肿瘤作用；和iii)在受体小鼠中再灌注的自DNA接种小鼠的血浆分离的外泌体的免疫原性。此外，研究了Nefmut的异位表达是否以及如何有效地导致工程化外泌体的释放。用C2C12细胞获得的数据支持了这样的观点，即Nefmut累积到由小鼠肌细胞释放的外泌体样纳米囊泡中，其水平与人细胞中可检测的那些相似。研究不包括终末分化的肌细胞，即小鼠中最有可能通过i.m.接种靶向的细胞类型。已经假设在这些细胞中，囊泡细胞内运输的潜在机制不会改变，至少在定性上是这样的。在这个问题上，来自i.m.接种基于Nefmut的DNA载体的小鼠的血浆中工程化外泌体的检测支持Nefmut也可以在分化的肌细胞释放的外泌体中累积的观点。理论上，不能排除至少部分注射的DNA可以通过例如DNA在引流淋巴结中扩散的方式靶向其他细胞类型，其中DNA可能被捕获并被树突细胞(DC)内化。然而，考虑到表达Nefmut/E7的DNA的sub-cute接种(预期其优先靶向DC)产生显著较弱的E7特异性CD8+T细胞免疫反应(未显示)，合理的是DC的DNA摄取不是这里描述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达融合蛋白的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的DNA表达载体，所述融合蛋白包含在C末端与免疫原性抗原融合的序列SEQ ID NO:1的外泌体锚定蛋白、或由其组成，其通过诱导CTL免疫反应用于疫苗预防和治疗中，其中SEQ ID NO:1是以下序列：MGCKWSKSSV VGWPAVRERM RRAEPAADGV GAASRDLEKH GAITSSNTAA TNADCAWLEA QEEEEVGFPV TPQVPLRPMT YKAAVDLSHF LKEKGGLEGL IHSQRRQDIL DLWIYHTQGY FPDWQNYPTG PGIRYPLTFG WCYKLVPVEP EKLEEANKGE NTSLLHPVSL HGMDDPGREV LEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.11 IT 1020160001017941.表达融合蛋白的核苷酸序列或包含所述核苷酸序列的DNA表达载体，所述融合蛋白包含在C末端与免疫原性抗原融合的序列SEQIDNO:1的外泌体锚定蛋白、或由其组成，其通过诱导CTL免疫反应用于疫苗预防和治疗中，其中SEQIDNO:1是以下序列：MGCKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYPTGPGIRYPLTFGWCYKLVPVEPEKLEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPGREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC。2.根据权利要求1的用于所述用途的核苷酸序列或DNA表达载体，其中所述核苷酸序列或DNA表达载体通过肌肉内施用来施用。3.根据权利要求1-2任一项的用于所述用途的核苷酸序列或DNA表达载体，其中所述抗原选自人乳头瘤病毒抗原如E6和E7，HIV抗原如Gag和Tat，埃博拉病毒抗原如VP24、VP40、NP和GP，西尼罗河病毒抗原如NS3，HBV抗原如Core，HCV抗原如Core、NS3、E1和E2，克里米亚-刚果病毒抗原如GP和NP，甲型流感病毒抗原如NP和M1，人黑素瘤抗原如MAGE-A3和MART-1，人肿瘤相关抗原如Her2/Neu、HoxB7。4.根据权利要求1-3任一项的用于所述用途的核苷酸序列或DNA表达载体，其中表达序列SEQIDNO:1的外泌体锚定蛋白的核苷酸序列是以下核苷酸序列SEQIDNO:2：atgggttgcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctgctgtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccaggaccaggggttagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagagaagttagaagaagccaacaaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgacccggcgagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctga。5.根据权利要求1-4任一项的用于所述用途的核苷酸序列或DNA表达载体，其用于预防和治疗选自慢性传染病如HBV、HCV和HIV，结核病和疟疾，急性传染病如流感、西尼罗河、克里米亚-刚果出血热和埃博拉病，肿瘤如乳腺、肺、前列腺或膀胱肿瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·P·M·费德里科，
申请(专利权)人：国家高等卫生院，
类型：发明
国别省市：意大利,IT