虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体及其使用方法技术

本发明专利技术涉及虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体、编码它们的多核苷酸、制备和使用前述物质的方法、以及用Nav1.7的肽抑制剂减轻疼痛的方法。本发明专利技术的一个实施例包括含有载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发明专利技术的虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体的分离的多核苷酸。

Variant of Toxin-IV from Tiger-pattern Bird-catching Spider and Its Application

【技术实现步骤摘要】
虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体及其使用方法本申请是申请日为2013年5月17日，申请号为201380025986.1，专利技术名称为“虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体及其使用方法”的专利技术专利的分案申请。早前申请的交叉引用本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请61/781,276和2013年3月15日提交的美国专利申请13/833,555的权益，所述2篇申请要求2012年9月18日提交的美国临时申请61/702,538和2012年5月18日提交的美国临时申请61/648,871的权益，它们的整个内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体、编码它们的多核苷酸、制备和使用前述物质的方法、以及用Nav1.7的肽抑制剂减轻疼痛的方法。
技术介绍
电压门控钠通道(VGSC)存在于所有可兴奋细胞(包括心肌细胞和骨骼肌细胞以及中枢神经元和周围神经元)中。在神经元细胞中，钠通道负责放大阈下去极化和产生动作电位的快速上升。这样，钠通道是神经系统中的电信号的开始和传播所必需的。认为异常钠通道功能是多种医学病症的基础(Hübner和Jentsch,HumMolGenet11:2435-45,2002)，所述医学病症包括癫痫(Yogeeswari等人，CurrDrugTargets5:589-602,2004)、心律失常(Tfelt-Hansen等人，JCardiovascElectrophysiol21:107-15,2010)、肌强直(Cannon和Bean,JClinInvest120:80-3,2010)和疼痛(Cregg等人，JPhysiol588:1897-904,2010)。钠通道通常是多个亚基的复合物，基本亚基是成孔α-亚基，其单独足以起作用。在人类中存在电压门控钠通道(VGSC)α亚基家族的9个已知成员：Nav1.1-Nav1.9。Nav1.x亚家族可以在药理学上细分成河豚毒素(TTX)-敏感的或TTX-抗性的。Nav1.7(也被称作PN1、SCN9A或hNE)是TTX-敏感的，并且主要在周围交感神经元和感觉神经元中表达。Nav1.7聚集在神经纤维末梢，并放大小阈下去极化和充当调节兴奋性的阈通道。Nav1.7功能涉及不同的疼痛状态，包括急性疼痛、炎症性疼痛和/或神经性疼痛。在人类中，已经将Nav1.7的功能突变的获得与原发性红斑性肢痛症(PE，一种以灼痛和四肢炎症为特征的疾病)(Yang等人，JMedGenet41：171-4，2004)和阵发性极度疼痛障碍(PEPD)(Fertleman等人，Neuron52：767-74，2006)相关联。与该观察结果相一致，非选择性的钠通道阻滞剂利多卡因、美西律和卡马西平可以在这些疼痛障碍中提供症状缓解(Legroux-Crespel等人，AnnDermatolVenereol130：429-33，2003；Fertleman等人，Neuron52：767-74，2006)。SNC9A在人类中的功能缺失突变会造成先天性无痛觉症(CIP)，即以对疼痛刺激的完全淡漠或不敏感性为特征的罕见常染色体隐性障碍(Cox等人，Nature444：894-8，2006；Goldberg等人，ClinGenet71：311-9，2007；Ahmad等人，HumMolGenet16：2114-21，2007)。已经将SCN9A的编码区中的单核苷酸多态性与增加的伤害感受器兴奋性和疼痛敏感性相联系。例如，已经将导致人Nav1.7中的R1150W置换的多态性rs6746030与骨关节炎疼痛、腰椎间盘切除术疼痛、幻痛和胰腺炎疼痛相联系(Reimann等人，ProcNatlAcadSciUSA107：5148-53，2010)。表达R1150WNav1.7的DRG神经元响应于去极化而表现出增加的发射频率(Estacion等人，AnnNeurol66：862-6，2009)。已经将残废形式的纤维肌痛与SCN9A钠通道多态性rs6754031相联系，从而指示一些具有严重纤维肌痛的患者可能具有背根神经节钠通道病(Vargas-Alarcon等人，BMCMUSculoskeletDisord13：23，2012)。在小鼠中，SCN9A基因在感受伤害的神经元中的缺失会导致机械痛阈和热痛阈的下降以及炎症性疼痛应答的减少或消失(Nassar等人，ProcNatlAcadSciUSA101：12706-11，2004)。除去所有感觉神经元中的Nav1.7基因表达会消除机械疼痛、炎症性疼痛和对热的反射缩回应答。删除感觉神经元和交感神经元中的SCN9A会消除机械疼痛、热疼痛和神经性疼痛，并重现在具有SCN9A功能缺失突变的人类中观察到的无疼痛表型(Minett等人，NatCommun3：791，2012)。因此，Nav1.7抑制剂或阻滞剂可以用于治疗宽范围的与不同障碍有关的疼痛。已知蜘蛛毒素含有大量钠通道阻滞肽，包括虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HwTx-IV)(Peng等人，JBiolChem277：47564-71，2002)、原毒素-I、原毒素-II(Middleton等人，Biochemistry41：14734-47，2002)和Phrixotoxin-III(Bosmans等人，MolPharmacol69：419-29，2006)。得自中国捕鸟蛛虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonushuwena)的虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HWTx-IV)是Nav1.7和其它TTX-敏感的电压门控钠通道的有效阻滞剂，且可能通过将结构域II的电压传感器引导成向内封闭构象而充当门控修饰剂(Xiao等人，JBiolChem283：27300-13，2008)。由于它的有利效能和选择性谱，原毒素-II已经成为多个目的在于证实镇痛的体内研究的主题，它们都没有报道在不破坏神经束膜的情况下的成功。仅仅通过皮肤神经的脱鞘(Schmalhofer等人，MolPharm74：1476-1484，2008)或高渗盐水的神经束膜注射(其导致紧密连接蛋白封闭蛋白-1的减量调节)(Hackel等人，PNAS109：29E2018-27，2012)而实现的血液-神经屏障的颠覆是关于原毒素-II观察到的任何功效。需要鉴别用于治疗宽范围的疼痛适应症的其它Nav1.7阻滞剂。具体地，需要对Nav1.7具有胜过其它VGSC异形体的选择性的新型Nav1.7阻滞剂。附图说明图1a)和b)显示了对于制备的具有在指定残基位置处的特定置换的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体而言，Nav1.7对藜芦定诱导的膜去极化的抑制的IC50值。参考虎纹捕鸟蛛毒素-IV残基对应于SEQIDNO：267的多肽中的残基。以灰色突出显示的置换产生了具有≤300×10-9M的IC50值的变体。以＞开始的值指示，特定变体在指定的浓度是无活性的。图2a)和b)显示了对于制备的具有在指定残基位置处的特定置换的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体而言，Nav1.2对藜芦定诱导的膜去极化的抑制的IC50值。参考虎纹捕鸟蛛毒素-IV残基对应于SEQIDNO：267的多肽中的残基。以＞开始的值指示，特定变体在指定的浓度是无活性的。图3a)和b)显示了对于每种具有在指定残基位置处的特定置换的变体而言，制备的虎纹捕本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体，其包含序列X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28 (SEQ ID NO: 357)；其中i) X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；ii) X2是R、F、W、N、S或L；iii) X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；iv) X4是Y、V或I；v) X5是R、W、Q、S或K；vi) X6是R、E、Y、F、V或A；vii) X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；viii) X8是P或V；ix) X9是R、F、Q、V或S；x) X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；xi) X11是D、P或W；xii) X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；xiii) X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；xiv) X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；xv) X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；xvi) X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；xvii) X17是K、R、Y、F、W、P或L；xviii) X18是K、R、T、A、L或V；xix) X19是S或I；xx) X20是K、W、G、A、I、R或D；xxi) X21是Y、W、A、H或K；xxii) X22是T或V；xxiii) X23是K、H、W、N、G、A、L或R；xxiv) X24是W或K；xxv) X25是W、T、I或Y；xxvi) X26是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；xxvii) X27是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；和xxviii) X28是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失，和所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体具有对人Nav1.7 (SEQ ID NO: 263)而言约300x10...

【技术特征摘要】
2012.05.18 US 61/648871;2012.09.18 US 61/702538;201.一种分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(SEQIDNO:357)；其中i)X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；ii)X2是R、F、W、N、S或L；iii)X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；iv)X4是Y、V或I；v)X5是R、W、Q、S或K；vi)X6是R、E、Y、F、V或A；vii)X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；viii)X8是P或V；ix)X9是R、F、Q、V或S；x)X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；xi)X11是D、P或W；xii)X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；xiii)X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；xiv)X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；xv)X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；xvi)X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；xvii)X17是K、R、Y、F、W、P或L；xviii)X18是K、R、T、A、L或V；xix)X19是S或I；xx)X20是K、W、G、A、I、R或D；xxi)X21是Y、W、A、H或K；xxii)X22是T或V；xxiii)X23是K、H、W、N、G、A、L或R；xxiv)X24是W或K；xxv)X25是W、T、I或Y；xxvi)X26是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；xxvii)X27是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；和xxviii)X28是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失，和所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7(SEQIDNO:263)而言约300x10-9M或更低的IC50值，前提条件是，所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不是包含SEQIDNO:1中所示序列的多肽。2.根据权利要求1所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述变体包含序列X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21TX22WCKYX23IX24X25(SEQIDNO:359)；其中i)X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；ii)X2是R、F、W、N、S或L；iii)X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；iv)X4是Y、V或I；v)X5是R、W、Q、S或K；vi)X6是R、E、Y、F、V或A；vii)X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；viii)X8是P或V；ix)X9是R、F、Q、V或S；x)X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；xi)X11是D、P或W；xii)X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；xiii)X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；xiv)X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；xv)X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；xvi)X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；xvii)X17是K、R、Y、F、W、P或L；xviii)X18是K、R、T、A、L或V；xix)X19是S或I；xx)X20是K、W、G、A、I、D或R；xxi)X21是Y、W、A、H或K；xxii)X22是K、H、W、N、G、A、L或R；xxiii)X23是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；xxiv)X24是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；和xxv)X25是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失。3.根据权利要求1所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1...

【专利技术属性】
技术研发人员：W埃科特，M弗林斯帕奇，M亨特，Y刘，R内夫，A维肯登，A吉布斯，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US