多种改进型橙/红色荧光蛋白制造技术

本发明专利技术涉及多种改进型橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed氨基酸序列的改造，获得的新型荧光蛋白与野生型具有不同的特点。本发明专利技术获得了一种与mOrange2类似但更亮的单体结构橙色荧光蛋白，其荧光亮度比mOrange2高2.0倍。本发明专利技术还获得了一种新型的紫红色荧光蛋白，该荧光蛋白具有特异性的最大激发波长和最大发射波长。本发明专利技术还涉及将改进型的荧光蛋白用于多领域的研究，采用将荧光蛋白融合在靶标蛋白N端或C端，在细胞系或活体动物中表达该融合蛋白，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等多种进行分析。

Various improved orange/red fluorescent proteins

The present invention relates to a variety of improved orange/red fluorescent proteins. By modifying the amino acid sequence of the red fluorescent protein DsRed from the coral Discosoma sp., the new fluorescent protein obtained has different characteristics from the wild type. The invention obtains an orange fluorescent protein with a brighter monomer structure similar to mOrange 2, whose fluorescence brightness is 2.0 times higher than that of mOrange 2. The invention also obtains a novel purple red fluorescent protein, which has a specific maximum excitation wavelength and a maximum emission wavelength. The invention also relates to the application of improved fluorescent protein in multi-field research. The fusion protein can be expressed in cell lines or living animals by fusing the fluorescent protein at the N or C ends of the target protein. The target protein can be analyzed by locating, tracing and functional display in cells, subcells and living tissues.

【技术实现步骤摘要】
多种改进型橙/红色荧光蛋白本申请是申请号为201510003374.3、申请日为2015年01月06日、专利技术名称为“多种改进型橙/红色荧光蛋白”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一些改进型的橙/红色荧光蛋白，通过对来自珊瑚虫Discosomasp.红色荧光蛋白DsRed序列的改造，所得新型荧光蛋白与野生型具有明显不同的颜色(激发光谱和发射光谱)、荧光强度等特点。本专利技术还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及其可与蛋白在N端或在C端融合，在细胞系或活体动物中表达，可对靶标蛋白进行细胞、亚细胞和活体组织内的定位，示踪，功能展示等进行多种分析。
技术介绍
荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应用。尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用。荧光标签众多，如何选择荧光蛋白更好的显示靶标蛋白的示踪和功能，主要考虑以下几个方面：1)荧光蛋白表达亮度高，无毒性；2)荧光蛋白具有很好的光稳定性；3)不能选择多聚体的荧光蛋白；4)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；5)要有多通道，不相互干扰的荧光蛋白。红色荧光蛋白drFP583(DsRed)是从Discosomasp.分离得到的(Matzetal.,NatureBiotech.17:969-973(1999),Grossetal.,Proc.Nat'LAcad.Sci.USA97:11990-11995(2000))，其优点显而易见：可与GFP系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，能够与现有的共聚焦和宽视场显微镜滤光片等具有很好的包容性，红光的穿透性尤其适用于对活体动物组织的成像，因而红色荧光蛋白显得尤为重要。在哺乳动物细胞中，无论是自发荧光还是对红光区的光吸收都大为减少，因此红色荧光探针的发展对于检测厚标本和活体动物成像都是非常重要的。在后续的荧光使用中，逐渐在荧光蛋白的单体化，适应多细胞区域表达，荧光稳定性等多方面对红色荧光蛋白有了更多的需求，而DsRed为4聚体蛋白，高度聚集的形式不利于与蛋白融合表达来观察蛋白的表达定位，功能等的能力，因此开展了更大规模的红色荧光蛋白突变体筛选工作。但将DsRed突变为单体后，其光稳定性大大缩短，无法满足共聚焦的成像要求，并且由于改变了发光体的结构，容易形成更多不同颜色差异的红色荧光蛋白。因此，目前红色荧光蛋白进化的焦点集中在两个目标上，第一完善当前己有的单体红色荧光蛋白，使得它们的荧光特性或稳定性等特征进一步优化；第二是开发能发红光的荧光蛋白，甚至是发射波段处于远红外区的荧光蛋白。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。mOrange2为从DsRed蛋白基础上突变获得橙红色的荧光突变体，其激发光谱为549nm，发射光谱为565nm。既可在红色荧光下发红光，也可以在橙色荧光下发橙色的光。相对于DsRed红色荧光蛋白，mOrange2形成了更有利于蛋白融合表达的单体形式，并且蛋白成熟速度快，但荧光强度虽略有下降，其光稳定性虽比DsRed四聚体差，但相对于大多数单体红色荧光蛋白，其光稳定性完全可以保证共聚焦的成像要求(表1)。由于mOrange2明显的光稳定优势，与其融合表达的蛋白可以在高强度的共聚焦显微镜下清晰的显示蛋白在细胞内或组织内表达的荧光图像(NathanC.Shaner等，Improvingthephotostabilityofbrightmonomericorangeandredfluorescentproteins.NatMethods.2008；5(6):545–551)。表1：红色荧光蛋白的荧光特性本专利技术欲以DsRed的序列为模板，对其荧光结构的构建位点进行饱和突变，并且增加了随机突变的文库来筛选单体结构，荧光强度高，光稳定性强等特性的红色荧光蛋白，即在保证单体结构适于与靶标蛋白融合表达的基础上，重点优化其亮度和光稳定性。本专利技术获得了3株突变为不同颜色的高亮度荧光蛋白，其中一株橙红色荧光蛋白OFPSpark(sRFP10)的亮度明显增强，可以更好的增强蛋白融合后的荧光蛋白亮度。另一株sRFP2蛋白为一新激发波长的荧光蛋白，相对于常见的红色荧光蛋白，该荧光蛋白的激发和发射波长更长，具有一定的特色。
技术实现思路
本专利技术的一个方面，提供了一种新的荧光蛋白OFPSpark(sRFP10)，该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其特征在于由SEQ.ID.NO:7所示氨基酸序列中包含了E10P，R17H，E32V，H41F，Q64H，K83L，F99Y，T147S，L150M，E160K，L225Q位置上由相应的氨基酸替换。所述荧光蛋白激发峰是549nm，发射峰是566nm，呈橙红色，可以分别在橙色和红色激发光谱下反射荧光。与亲本蛋白相比(DsRed的激发峰为558nm，发射峰为583nm)，所述荧光蛋白为单体形式，并且保留了很强的荧光亮度，可在多种哺乳动物细胞中能获得良好表达，激发出明显的荧光。本专利技术的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO:5所示氨基酸序列的荧光蛋白sRFP2，该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其中包含如下氨基酸替换:E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q,A64H，C116T，F117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q。与亲本蛋白比，其光谱范围红移，所述荧光蛋白激发峰是577nm，发射峰是602nm，呈一种很漂亮的紫红色。本专利技术的又一方面，提供了一种由SEQ.ID.NO:9所示氨基酸序列的荧光蛋白sRFP12，该荧光蛋白是由DsRed红色荧光蛋白突变而来，其中包含如下氨基酸替换:E10P，R17H，E32V，R36K，K47Q，K83C，L85A，I210Y，L225Q。与亲本蛋白比，所述荧光蛋白激发峰是547nm，发射峰是565nm，呈一种很漂亮的玫红色。本专利技术的又一方面，还提供了OFPSpark和sRFP2荧光蛋白与表达于多种细胞器中靶标蛋白进行融合表达，可检测细胞内靶标蛋白的表达、定位，及标记相互作用蛋白等多种用途。即将OFPSpark荧光蛋白基因序列放在靶标蛋白的N端或C端融合在一起后，装载到哺乳动物细胞的表达载体中，将表达载体采用不同的方式转染细胞或活体组织，转染24～120小时后，可在专业荧光成像设备下观察荧光图像。附图说明图1：高纯度的3株红色突变克隆蛋白溶液，sRFP2，OFPSpark(sRFP10)和sRFP12的颜色分别为紫红，橙红色和玫红；图2：红色荧光突变蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，结果显示sRFP2的最大激发波长578nm，最佳发射波长602nm；OFPSpark(sRFP10)的最大激发波长549nm，最佳发射波长566nm；sRFP12的最大激发波长548nm，最佳发射波长565nm；图3：pCMV3-sRFP2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型红色荧光蛋白，其特征在于：a)为珊瑚虫Discosoma sp.红色荧光蛋白DsRed的突变体；b)其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:5,包含了氨基酸替换E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q；编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ.ID.NO:4；且c)该荧光蛋白在范围为532.5～587.5nm波长通道激发光下为红色荧光。

【技术特征摘要】
1.一种新型红色荧光蛋白，其特征在于：a)为珊瑚虫Discosomasp.红色荧光蛋白DsRed的突变体；b)其氨基酸序列为SEQ.ID.NO:5,包含了氨基酸替换E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q；编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ.ID.NO:4；且c)该荧光蛋白在范围为...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙春昀，谢良志，饶木鼎，赵淑环，徐明明，陈军，
申请(专利权)人：北京义翘神州科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11