一种生产水解过敏原的方法技术

一种从过敏原生产水解过敏原的方法，包括以下步骤：a)对包含过敏原蛋白的过敏原来源进行提取，从而形成提取物，b)纯化所述提取物以除去非蛋白组分从而形成纯化的提取物，c)使用第一变性剂对所述纯化的提取物进行变性，从而形成纯化的变性提取物，d)精制所述纯化的变性提取物，以除去杂质，从而形成精制的变性提取物,e)使用第二变性剂对所述精制的变性提取物进行变性，从而形成变性的过敏原混合物，和f)对所述变性的过敏原混合物进行水解，从而形成所述水解的过敏原。

A Method for Producing Hydrolysis Allergens

【技术实现步骤摘要】
一种生产水解过敏原的方法本申请是申请日为2012年06月15日、申请号为201280029646.1、专利技术名称为“一种生产水解过敏原”的专利技术申请的分案申请。本专利技术涉及一种生产水解过敏原的方法，更精确地，涉及过敏反应原性减弱的水解过敏原。生产水解过敏原的一般方法为WO2008/000783A1所揭示。该专利技术公开的方法包括了对不同的天然原料(如奶、毒素、鸡蛋、野草、青草、树、灌木、花、蔬菜、谷物、真菌等)进行提取、纯化、变性和水解的步骤。然而，使用已知方法所进行的先进的实验研究表明，过敏原蛋白(allergenprotein)的水解是复杂的，并且需要进一步的操作步骤以便完全地水解过敏原蛋白。本专利技术的一个目的在于，克服现有技术中的至少一些缺陷，特别是提供一种来自天然过敏原的抗原，所述抗原相较过敏原粗提取物具有显著减弱的引发过敏反应的能力，却能激发B细胞和T细胞。专利技术目的通过一种从过敏原生产水解过敏原的方法而得到解决，该方法包含以下步骤：a)对包含过敏原蛋白(allergenicprotein)的过敏原来源进行提取，从而形成提取物，b)纯化所述提取物，以除去非蛋白组分，从而形成纯化的提取物，c)使用第一变性剂对所述纯化的提取物进行变性，从而形成纯化的变性提取物，d)精制所述纯化的变性提取物，以除去杂质，从而形成精制的变性提取物,e)使用第二变性剂对所述精制的变性提取物进行变性，从而形成变性的过敏原混合物，和f)对所述变性的过敏原混合物进行水解，从而形成所述的水解过敏原。出人意料的是，已表明，经过两个变性步骤，过敏原蛋白可以被完全水解。如本文所用，“提取”是用提取介质(包括水、缓冲液或有机溶剂)处理过敏原(来)源(allergensource)，以将可溶性成分与不溶性残留物分开。优选使用水性体系(包括至少50％的水)。如本文所用，“变性”是蛋白失去其四级、三级和二级结构的过程，该术语尤其是指使用一种或多种变性剂进行处理。步骤a)是提取步骤。优选使用含水溶液进行提取。适合的盐为，例如但不限于：磷酸氢二钠、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、醋酸盐、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。同样，与许多其他提取方式相比，优选提取介质的量相对较大，即为过敏原来源重量的至少20倍，优选其重量的100倍或更多。在附图和实施方式中，提取物被称为为粗蛋白提取物。步骤b)为纯化步骤。对过敏原来源进行提取之后，即步骤a之后，提取物被纯化(步骤b)，以去除非蛋白成分，例如糖、磷脂、核酸等物质。如糖、磷脂、核酸和同类物质。提取物的纯化，可通过以下一种或多种操作进行：-离子交换色谱步骤(包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱),-分子(尺寸)排阻色谱步骤(也称为凝胶过滤)，-沉淀步骤，-疏水作用色谱(hydrophobicinteractionchromatography)步骤，-假亲合色谱和亲合色谱，和/或-透析过滤(渗滤)。在一优选实施方式中，使用离子交换色谱。其中，当使用阳离子交换剂时，负载溶液(loadingsolution)的pH值处于阳离子交换剂的酸性功能团的pKa值和具有提取物中蛋白的最低pKa值的蛋白的pKa值之间。当使用阴离子交换剂时，则pH值处于阴离子交换剂的碱性功能团的pKa值和具有构成提取物的蛋白质的最高pKa值的蛋白质的pKa值之间。通过这个方法，所有蛋白与离子交换剂结合，而中性杂质以及具有与离子交换树脂相同电荷的杂质则被除去。或者，可通过加入至少50％(w/v)硫酸铵，来沉淀所述的过敏原蛋白，更优选地，加入至少90％(w/v)硫酸铵。在一优选实施方式中,也可通过加入至少2％(w/v)三氯乙酸(TCA)，优选5％(w/v)，更优选至少10％(w/v)TCA，进行沉淀。典型地，多种不同的蛋白会存在于纯化提取物的蛋白组分中。采用如SDS-PAGE并随后用密度测定等方法，可以容易测定纯化提取物中蛋白的相对量。步骤c)为第一变性步骤。作为下一个步骤(步骤c))，进行变性操作。所述变性剂优选为离液剂(chaotropicagent)、还原剂或它们的混合物。适合的离液剂为，例如尿素和盐酸胍。典型的还原剂为，例如，二硫苏糖醇，β-巯基乙醇，硫代甘油，三(2-羧乙基)膦(TCEP)及它们的混合物。对于第一变性步骤，典型的pH值为7.0-11.0，优选地为7.0-10.0，更优选地为7.0-9.0。优选地，变性在15-40℃(更优选20-37℃)下进行至少15分钟，优选至少30分钟，更优选地至少60分钟，。在一优选实施方式中，用于变性的还原剂为DTT(二硫苏糖醇)。适合的尿素浓度为3M或更高，优选4M或更高。适合的胍盐(guanidinium)浓度优选为2M，更佳地3M或更高。步骤d)为纯化步骤。作为步骤d)，执行进一步纯化。在一优选实施方式中，使用凝胶过滤法或透析过滤工艺。使用色谱，特别是尺寸排阻色谱是优选的。据信，通过步骤d)，进一步的纯化杂质可以从制剂中被去除，而所述的杂质是不与过敏原的蛋白组分共价结合且已通过步骤c)同蛋白分离开的杂质。步骤e)为第二变性步骤。在步骤d之后，进行第二(次)变性步骤(步骤e))。对于此变性步骤，使用第二变性剂，而所述第二变性剂可以与步骤c)的变性剂相同或具有不同组成。在一优选实施方式中，用于第二变性步骤的还原剂为TCEP。优选地，第二变性步骤的pH值设定为1.5-9.0。优选地，所述pH接近于步骤f)所使用的选定的酶的最佳活性pH。在一优选实施方式中，所述pH低于7.0或低于5.0或低于3.0但优选高于1.0。优选地，变性在15-40℃(更优选20-37℃)下进行至少15分钟，优选至少30分钟，更优选地至少60分钟。下一个步骤(步骤f))为水解步骤。所述水解步骤典型地使用酶进行操作。适合的酶为，例如，胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶。可以在离液剂(优选尿素或盐酸胍)存在下进行水解步骤。水解时，尿素和盐酸胍的浓度应低于4M，优选低于3M。水解步骤也可在还原剂(优选TCEP)存在下进行。水解时，TCEP的浓度优选低于10mM。优选地，使用胃蛋白酶。更优选地，胃蛋白酶的使用pH范围为1.0–3.0。步骤g)为对水解过敏原的纯化和挑选。在下一步(步骤g))中，所述水解过敏原可以被纯化形成纯化的水解物，其中具体地，肽片段(典型地，分子量低于1,000道尔顿的片段)以及例如分子量高于10,000道尔顿的肽和/或蛋白的未水解片段被去除。因此，纯化水解物的肽包括了分子量在1,000-10,000道尔顿之间的肽。优选地，低于10％的肽的分子量高于10,000道尔顿并且低于20％的肽的分子量低于1,000道尔顿，从而使得70％，或更优选地80％肽的分子量在10,000道尔顿至1,000道尔顿之间。用于去除大肽或小肽的合适方法为超滤和尺寸排阻色谱。同样，该尺寸排阻色谱可以在离液剂存在下进行操作，例如尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇、以及它们的混合物。优选地，通过尺寸排阻色谱和/或通过超滤进行水解肽的纯化。其中优选地在离液剂存在下进行所述尺寸排阻色谱步骤的操作，所述离液剂优选选自尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇及它们的混合物。所述水解物的一个优势是，所述肽是纯化变性蛋白的消化产物，其诱导即时过敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从过敏原生产水解过敏原的方法，包括以下步骤：a)对包含过敏原蛋白的过敏原来源进行提取，从而形成提取物，b)纯化所述提取物，以除去非蛋白组分，从而形成纯化的提取物，c)使用第一变性剂在pH7.0到11.0对所述纯化的提取物进行变性，从而形成纯化的变性提取物，d)精制所述纯化的变性提取物，以除去杂质，从而形成精制的变性提取物,e)使用第二变性剂在pH1.0到7.0对所述精制的变性提取物进行变性，从而形成变性的过敏原混合物，和f)对所述变性的过敏原混合物进行水解，从而形成所述的水解过敏原，和g)纯化所述水解过敏原，从而去除分子量大于10,000道尔顿且低于1,000道尔顿的肽，其中70％或更多的所述肽在1,000‑10,000道尔顿之间。

【技术特征摘要】
2011.06.15 EP 11170031.61.一种从过敏原生产水解过敏原的方法，包括以下步骤：a)对包含过敏原蛋白的过敏原来源进行提取，从而形成提取物，b)纯化所述提取物，以除去非蛋白组分，从而形成纯化的提取物，c)使用第一变性剂在pH7.0到11.0对所述纯化的提取物进行变性，从而形成纯化的变性提取物，d)精制所述纯化的变性提取物，以除去杂质，从而形成精制的变性提取物,e)使用第二变性剂在pH1.0到7.0对所述精制的变性提取物进行变性，从而形成变性的过敏原混合物，和f)对所述变性的过敏原混合物进行水解，从而形成所述的水解过敏原，和g)纯化所述水解过敏原，从而去除分子量大于10,000道尔顿且低于1,000道尔顿的肽，其中70％或更多的所述肽在1,000-10,000道尔顿之间。2.如权利要求1所述的方法，其中提取在溶液中操作，所述溶液不含盐或含选自下组的盐：碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、醋酸盐、TRIS和HEPES，其中提取优选用提取介质进行操作。3.如权利要求1所述的方法，其中所述纯化和/或精制包括一步或多步的离子交换色谱步骤、凝胶过滤法或尺寸排阻色谱步骤、沉淀步骤、疏水作用色谱步骤、假亲和色谱或亲合色谱步骤或透析过滤步骤。4.如权利要求3所述的方法，其中所述沉淀步骤用含三氯乙酸的溶液进行。5.如权利要求1所述的方法，其中变性用选自下组的变性剂进行：离散剂、还原剂或其混合物，优选地所述变性剂选自下组：尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇、硫代甘油、β-巯基乙醇，TCEP(三(2-羧乙基)盐酸膦)及其混合物，优选地所述第二变性剂是TCEP(三(2-羧乙基)盐酸膦)。6.如权利要求5所述的方法，其中所述变性剂包括浓度大于4M的尿素和浓度高于3M的盐酸胍。7.如前述权利要求1所述的方法，其中所述水解用酶进行，所述酶优选胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶，更优选地，其中水解在离液剂和还原剂存在下进行。8.如权利要求1所述的方法，其中对肽的去除通过尺寸排阻色谱和/或超...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·普拉西尔，L·弗里西，T·莱贡，MA·贝努瓦，
申请(专利权)人：阿西特生物技术股份公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE