检测BRCA1基因的荧光生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种检测BRCA1基因的荧光生物传感器及其制备方法。用于BRCA1基因检测的复合物包括生物素修饰的DNA Walker链(DWTs)、保护探针(PP)、生物素修饰的底物链DNA(SDs)、链霉亲和素修饰的磁珠(SMBs)、FAM修饰的荧光信号链P、Dabcyl修饰的L链、S链和辅助链A。本发明专利技术成功构建了可用于检测BRCA1的荧光生物传感器及检测体系。应用本发明专利技术的传感器，对BRCA1的测定显示了灵敏度高、稳定、重现性好的能力。与现有技术比较，本发明专利技术的传感器检测速度快、灵敏度高，操作简单方便，检测周期短，灵敏度高，特异性好，假阳性率和假阴性率低。适用于实际样品的测定等，有望成为具有实际应用价值的传感器。

Fluorescent biosensor for detecting BRCA1 gene and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
检测BRCA1基因的荧光生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种检测BRCA1基因的荧光生物传感器及其制备方法。
技术介绍
中国过去被认为是一个低风险的乳腺癌国家，但近年来，随着人们生活水平的不断提高，生活方式的改变和工业化造成的周围环境污染，中国乳腺癌的发病率是以每年3％-4％的速度增长，远高于国际平均年增长率。中国目前已经成为乳腺癌发病的主要国家。根据世界人口标准化发病率和死亡率排名，乳腺癌发病率在所有恶性肿瘤中排名第四，死亡率在所有肿瘤中排名第六。在中国沿海发达省份，乳腺癌的发病率远远高于其他地区。乳腺癌目前已经成为我国癌症防治的重点。早期发现、早期诊断和早期治疗是降低癌症死亡率的最重要手段。实现“三早”的目标主要取决于肿瘤的早期筛查。筛查可以是对广泛人群的一般调查，也可以是对高风险群体的定期监测。毫无疑问，识别高危人群的乳腺癌，提高他们的癌症意识，进行自我检查和临床筛查，如关键目标放射摄影和B超检查，与广泛的一般调查相比较人，这对于降低社会成本和更合理地分配医疗资源更为重要。目前，我国对于乳腺癌检测常采用钼靶治疗，但是该方法存在对于小癌灶容易漏诊且有时不能提供明确的定性诊断。而血清学检查多采用酶联免疫吸附试验(ELISA)联合免疫印迹法(WB)检测相应的抗体。虽然血清学检测特异性好，适合于临床及血液筛查等大样本量的检测，但其需要相应的仪器设备及接受过特殊培训的技术人员。且由于技术原因，不能完全排除相互干扰的可能性，其灵敏度较差，不能满足早期诊断的需求。因而，需要更早期的标志物用于乳腺癌的检测。在抗体产生之前，感染者体内最早可被检测到的是核酸。核酸检测不依赖抗体的产生，可明显缩检测周期。通常核酸检测具有以下特点：①样品用量少，并可检测低丰度含量样品；③不依赖抗体的产生，在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前即可检测，适用于早期诊断；④可对BRCA基因进行基因分型，比血清分型更有价值；⑤灵敏度高(可达nM甚至fM水平，理论上能检出单个病毒基因)，特异性好，快速、简捷。乳腺癌易感基因BRCA1是一种定位于17号染色体上的17q21，属于抑癌基因，具有维持基因组稳定性的功能，与其它肿瘤抑制因子和信号传感器等组成复合物，在基因转录、DNA损伤修复及重组中扮演重要作用，此外，它还和其他多种癌症息息相关，诸如卵巢癌、胰腺癌和结肠癌等。BRCA1异常表达将会引起DNA损伤修复、转录调节以及细胞周期检查点等功能的改变，从而引起女性患癌症风险的增加。因此建立一种简便、快捷、高灵敏的检测BRCA1的方法显得尤为重要。在近些年来，生物传感技术已经被建立用于核酸分析，包括有电化学、荧光、化学发光等。荧光检测具有操作简单、稳定性好以及检测速度快等优势。目前虽然有使用荧光策略检测BRCA1基因，但结合DNAWalker机器以及熵驱动链置换反应来实现BRCA1基因高灵敏检测的方法还未有报道。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测BRCA1基因的荧光生物传感器及其制备方法，用于解决现有技术中对BRCA1基因的检测特异性差、过程繁琐、检测时间长等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种用于BRCA1基因检测的复合物，包括生物素修饰的DNAWalker链(DWTs)、保护探针(PP)、生物素修饰的底物链DNA(SDs)、链霉亲和素修饰的磁珠(SMBs)。可选地，所述DNAWalker链的核苷酸序列含有如SEQIDNO.2所示序列。可选地，所述保护探针的核苷酸序列含有如SEQIDNO.3所示序列。可选地，所述底物链DNA的核苷酸序列含有如SEQIDNO.4所示序列。可选地，所述链霉亲和素修饰的磁珠可从市场上购买得到，具体可以购自美国NEB公司等。可选地，所述BRCA1基因的核苷酸序列含有如SEQIDNO.1所示序列。所述用于合成PWTs-SDs-SMB复合物中双链DWTs为64nt，其相应的碱基序列为：5'-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATAGGGTTTCTCTTGGCCTCA*GC-3'；其中下划线标出的碱基序列“CCTCAGC”为限制性核酸内切酶的识别序列，*表示限制性核酸内切酶的剪切位点，所述双链DWTs的5'端进行生物素化修饰。可选地，所述用于合成PWTs-SDs-SMB复合物中底物链SDs的长度为29nt，其相应的碱基序列为5'-Biotin-TTTTTTGC*TGAGGTAGAGATTTTCCACAT-3'，其中下划线标示的部分为所述限制性核酸内切酶的识别序列，*表示限制性核酸内切酶的剪切位点，所述底物链SDs的5'端进行生物素化修饰。本专利技术还提供一种用于BRCA1基因检测的试剂盒，包括上述复合物。可选地，还包括三链体复合物L-P-S，所述的三链体复合物由DNA单链L、单链P、单链S组成，所述单链L的核苷酸序列含有如SEQIDNO.5所示序列，所述单链P的核苷酸序列含有如SEQIDNO.6所示序列，所述单链S的核苷酸序列含有如SEQIDNO.7所示序列。可选地，所述L链、P链、S链的摩尔比为1.2:1:1.2可选地，还包括辅助链A，所述辅助链A的核苷酸序列含有如SEQIDNO.8所示序列。本专利技术还提供一种用于检测BRCA1基因的试剂盒的制备方法，包括制备PWTs-SDs-SMBs复合物：将生物素修饰的DNAWalker链、保护探针混合反应，制得保护DNAWalker链(即双链PWTs，也可称为受探针保护的DNAWalker链)，将制得所述PWTs-SDs-SMBs复合物。可选地，所述生物素修饰的底物链DNA与所述保护DNAWalker链的摩尔浓度比为20:1。可选地，将生物素修饰的DNAWalker链、保护探针溶解在TE缓冲液中，混合反应，制得保护DNAwalker链。可选地，所述TE缓冲液包括10mMTris-HCl、1mMEDTA，该TE缓冲液可以从市场上购买得到。可选地，所述保护DNAwalker链的形成条件为：90℃，孵育时间5min。可选地，所述PWTs-SDs-SMB复合物形成条件为：37℃，孵育时间40min。可选地，所述DNAWalker链的核苷酸序列含有如SEQIDNO.2所示序列。可选地，所述保护探针的核苷酸序列含有如SEQIDNO.3所示序列。可选地，所述底物链DNA的核苷酸序列含有如SEQIDNO.4所示序列。可选地，所述链霉亲和素修饰的磁珠可从市场上购买得到，具体可以购自美国NEB公司等。可选地，还包括制备三链复合物L-P-S：将所述DNA单链L、P、S充分混合，变性后，制得三链复合物L-P-S。可选地，所述单链L的核苷酸序列含有如SEQIDNO.5所示序列，所述单链P的核苷酸序列含有如SEQIDNO.6所示序列，所述单链S的核苷酸序列含有如SEQIDNO.7所示序列。可选地，还包括在所述三链复合物L-P-S中加入辅助链A，所述辅助链A的核苷酸序列含有如SEQIDNO.8所示序列。如上所述，本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术成功构建了可用于检测BRCA1的荧光生物传感器及检测体系。应用本专利技术的传感器，对BRCA1的测定显示了灵敏度高、稳定、重现性好的能力本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于BRCA1基因检测的复合物，其特征在于：包括生物素修饰的DNA Walker链(DWTs)、保护探针(PP)、生物素修饰的底物链DNA(SDs)、链霉亲和素修饰的磁珠(SMBs)。

【技术特征摘要】
1.一种用于BRCA1基因检测的复合物，其特征在于：包括生物素修饰的DNAWalker链(DWTs)、保护探针(PP)、生物素修饰的底物链DNA(SDs)、链霉亲和素修饰的磁珠(SMBs)。2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述DNAWalker链的核苷酸序列含有如SEQIDNO.2所示序列。3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述保护探针的核苷酸序列含有如SEQIDNO.3所示序列。4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述底物链DNA的核苷酸序列含有如SEQIDNO.4所示序列。5.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述生物素修饰的DNAWalker链(DWTs)、保护探针(PP)反应形成的保护DNAWalker链上具有限制性核酸内切酶Nb.BbvCI的识别序列。6.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述BRCA1基因的核苷酸序列含有如SEQIDNO.1所示序列。7.一种用于BRCA1基因检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-6任意一项所述复合物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包括三链体复合物L-P-S，所述的三链体复合物由DNA单链L、单链P、单链S组成，所述单链L的核苷酸序列含有如SEQIDNO.5所示序列，所述单链P的核苷酸序列含有如SEQIDNO.6所示序列，所述单链S的核苷酸序列含有如SEQIDNO.7所示序列；和/或，还包括辅助链A，所述辅助链A的核苷酸序列含有如SEQIDNO.8所示序列；和/或，还包括CutSmartbuffe...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜玉蓉，丁世家，程伟，马洪敏，晏小玉，王通，阙海英，刘萍，甘秀峰，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50