一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用技术方案

本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法，具体涉及一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用；本发明专利技术首次双位点敲除法，采用在同一外显子上设计两个sgRNA序列，针对该外显子上两个位点进行切割，可高效敲除FOXR1基因，且只需PCR、电泳即可确定是否敲除成功，大大降低了敲除后鉴定成本，且敲除后只有一种突变型，大大增加了敲除结果的稳定性；将含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9系统转染细胞，可获得敲除FOXR1基因的细胞株。

A CRISPR/Cas9 System for Double sgRNA Locus Knockout of FOXR1 Gene and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用
本专利技术属于生物工程
，特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法，具体涉及一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用。
技术介绍
FOXR1基因(forkheadboxR1)编码(Fox)家族许多成员的转录因子。FOX家族成员是具有约110aa的DNA结合结构域的单体螺旋螺旋蛋白。许多FOX转录因子在确定早期发育过程中的细胞命运起着重要作用。而FOXR1基因在神经母细胞瘤中表达急剧降低，根据这一特性，有助于发展新的肿瘤标志物和靶向治疗分子，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来消除入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA的进行定点切割，CRISPR/Cas系统具有操作简单，剪切效率高等特点。目前，CRISPR/Cas基因敲除技术已广泛应用于果蝇、大鼠、小鼠、斑马鱼等实验模型。传统的敲除方法使用一个sgRNA，针对一个位点进行敲除，虽然效率高，但DNA自主修复不确定性高，且缺失几个碱基不宜于鉴定，往往需要大量测序，花费大量资金进行鉴定。
技术实现思路
本专利技术解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用。为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：一种敲除FOXR1基因的sgRNA，包括FOXR1sgRNA-1和FOXR1sgRNA-2；所述FOXR1sgRNA-1的序列如下：FOXR1sgRNA-1：GTATCCCCCTGGAAAGCTGG(SEQIDNo.1)FOXR1sgRNA-1oligo1：5’-caccGTATCCCCCTGGAAAGCTGG-3’；(SEQIDNo.2)FOXR1sgRNA-1oligo2：5’-aaacCCAGCTTTCCAGGGGGATAC-3’；(SEQIDNo.3)所述FOXR1sgRNA-2的序列如下：FOXR1sgRNA-2：GAAAAGGCAAACCGCTTCCG(SEQIDNo.4)FOXR1sgRNA-2oligo1：5’-caccGAAAAGGCAAACCGCTTCCG-3’；(SEQIDNo.5)FOXR1sgRNA-2oligo2：5’-aaacCGGAAGCGGTTTGCCTTTTC-3’。(SEQIDNo.6)一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述FOXR1sgRNA-1和FOXR1sgRNA-2的DNA序列。一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法，包括以下步骤：步骤1，使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPRV2，得到酶切后的载体；步骤2，将所述靶向敲除FOXR1基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR-V2载体连接，得到得到靶向敲除FOXR1基因的LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-1&LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-2，构建靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统。所述靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统可用于制备敲除FOXR1基因的细胞株。一种敲除FOXR1基因的细胞株，所述细胞株是运用所述双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的FOXR1基因缺失的细胞株。优选地，所述细胞株为A549细胞株。优选地，所述的A549细胞株为人非小细胞肺癌细胞A549。优选地，所述FOXR1基因的具体靶向敲除位点为：TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTGTGGCCTGGGCTGGAGACCAGGGGCACCCAAAGCCAGTGGGCTGTGGCACACAATCTTTTGTTCTGCACAGGTCCAGATTATGAGCCCAACCTCTGGATGTGGGTAAATCCCAACATTGTGTATCCCCCTGGAAAGC-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AAGCGGTTTGCCTTTTCCCCCAGCACCTGGGAGGTATGCATTTTTGGGGATGGGAGTGGGACTTGGGCAGTAGGCGAGGGGCATGGGGAAGAGCCATTACAGTTCTGCTCTCTTAGCCATAGCAAAAGGTGAATGGGTTCAGAAATTACCTACATGCTTGGGTTGGGGAGAAGCCCAAATGGTGGCCTTAGACCACCCCCCCTTCCTGCCACTGCACCCTGGAGTAGAGGCTGAGGAGT。(SEQIDNo.10)所述敲除FOXR1基因的细胞株的制备方法，包括以下步骤：将含有sgRNA的质粒转染至细胞株，得到敲除FOXR1基因的细胞株；所述双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的鉴定方法为：步骤A，采用碱裂解法裂解细胞，释放细胞基因组DNA；步骤B，采用PCR扩增和凝胶电泳检测。优选地，所述PCR扩增的引物为：FOXR1-jc-F:TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTG(SEQIDNo.7)FOXR1-jc-R:ACTCCTCAGCCTCTACTCCA(SEQIDNo.8)相对于现有技术，本专利技术的优点如下，本专利技术在同一外显子上设计两个sgRNA序列，针对该外显子上两个位点进行切割，只需PCR、电泳即可确定是否敲除成功，大大降低了敲除后鉴定成本，且敲除后只有一种突变型，大大增加了敲除结果的稳定性；有技术一般采用单位点敲除法，本方法采用双位点敲除法；本专利技术的FOXR1sgRNA-1&FOXR1sgRNA-2敲除效率高，附图说明图1为LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-1&LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-2测序结果；图2为碱裂解法鉴定共转LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-1&LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-2电泳图；其中M为DNAMarker、-为阴性对照、+为共转双质粒；图3为碱裂解法鉴定共转LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-1单克隆电泳图；其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除FOXR1基因的sgRNA，其特征在于，包括FOXR1 sgRNA‑1和FOXR1 sgRNA‑2；所述FOXR1 sgRNA‑1的序列如下：FOXR1 sgRNA‑1：GTATCCCCCTGGAAAGCTGGFOXR1 sgRNA‑1 oligo1：5’‑caccGTATCCCCCTGGAAAGCTGG‑3’；FOXR1 sgRNA‑1 oligo2：5’‑aaacCCAGCTTTCCAGGGGGATAC‑3’；所述FOXR1 sgRNA‑2的序列如下：FOXR1 sgRNA‑2：GAAAAGGCAAACCGCTTCCGFOXR1 sgRNA‑2 oligo1：5’‑caccGAAAAGGCAAACCGCTTCCG‑3’；FOXR1 sgRNA‑2 oligo2：5’‑aaacCGGAAGCGGTTTGCCTTTTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种敲除FOXR1基因的sgRNA，其特征在于，包括FOXR1sgRNA-1和FOXR1sgRNA-2；所述FOXR1sgRNA-1的序列如下：FOXR1sgRNA-1：GTATCCCCCTGGAAAGCTGGFOXR1sgRNA-1oligo1：5’-caccGTATCCCCCTGGAAAGCTGG-3’；FOXR1sgRNA-1oligo2：5’-aaacCCAGCTTTCCAGGGGGATAC-3’；所述FOXR1sgRNA-2的序列如下：FOXR1sgRNA-2：GAAAAGGCAAACCGCTTCCGFOXR1sgRNA-2oligo1：5’-caccGAAAAGGCAAACCGCTTCCG-3’；FOXR1sgRNA-2oligo2：5’-aaacCGGAAGCGGTTTGCCTTTTC-3’。2.一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括权利要求1所述FOXR1sgRNA-1和FOXR1sgRNA-2的DNA序列。3.如权利要求2所述的双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPRV2，得到酶切后的载体；步骤2，将所述靶向敲除FOXR1基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR-V2载体连接，得到得到靶向敲除FOXR1基因的LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-1&LentiCRISPRV2-FOXR1sgRNA-2，构建靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统。4.如权利要求2或3所述靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统在制备敲除FOXR1基因的细胞株中的应用。5.一种敲除FOXR1基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株是运用权利要求2所述所述双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的FOXR1基因缺失的细胞株。6.如权利要求5所述的敲除FOX...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵恩峰，贺小宏，王延宾，任江涛，韩露，
申请(专利权)人：南京北恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32