一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种内分泌干扰物壬基酚半抗原和抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的壬基酚人工抗原为将式I所示的壬基酚半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明专利技术所提供壬基酚人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于壬基酚抗体的制备，以及食品中壬基酚残留检测具有重大价值。

A nonylphenol hapten and antigen and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途
本专利技术属于食品中内分泌干扰素净化、检测领域，涉及一种壬基酚半抗原和抗原及其制备方法和用途。
技术介绍
内分泌干扰物（Environmentalendocrinedisruptingchemicals，EDCs），是一种在环境中存在的干扰人或动物内分泌系统的外源性化学物质，多数通过食物链进入生物体内，引起生物体自身荷尔蒙被干扰，在血液中循环、脂肪中积累，从而导致生物体正常的生殖、发育、免疫、行为活动等生理系统异常。壬基酚（NonylPhenol，NP）是一种典型的内分泌干扰物，其结构与人和动物的雌激素十分相似，具有明显的雌激素效应，可以干扰人体内分泌的正常作用。NP是一种重要的精细化工原料和中间体，广泛应用于食品包装材料、食品贮藏容器以及工业洗涤剂、塑料增塑剂和稳定剂等，且食品用量正在逐年增加。有研究表明在矿泉水、碳酸饮料、罐头类食品中均有检出，人类通过摄食食品而暴露于这类物质中，据报道人体的尿液、血清和母乳中都存在着不同水平的NP。NP在环境中很难降解，且毒性大、滞留时间较长，通过食物链进入到人体中，也可以通过皮肤、呼吸、消化道等途径接触从而影响肝、肾、脾、肺等多种器官的健康。对食物中的壬基酚的残留水平进行准确测定是非常必要的。壬基酚目前的检测方法主要有气相色谱法和气-质联用法、液相色谱法和液-质联用法等。样品前处理方法主要包括液液萃取、固相萃取、基质固相分散萃取和加速溶剂萃取等。这些方法存在选择性差、有机溶剂使用量大、操作复杂和不同基质间重现性差等缺点，而且操作繁琐、仪器昂贵。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子物质残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种壬基酚半抗原、人工抗原及其制备方法和用途。本专利技术所提供的壬基酚半抗原，其结构如式I所示：式I。本专利技术所提供的制备所述式I的方法，具体可包括如下步骤：在壬基酚中加入二甲基甲酰胺（DMF）、氢化钠（NaH），所述壬基酚、DMF、NaH的配比为1000mg：30ml：50mg，室温反应15min获得反应液；在反应液中加入200mg4-溴丁酸乙酯，40℃油浴条件下反应，25ml乙酸乙酯萃取，蒸干，加入12mL乙酸乙酯将残留物溶解，称量2倍重量的硅胶加入其中，旋蒸干，准备硅胶柱上样。将混合好的硅胶样品使用干样加样法进行加样，用石油醚：乙酸乙酯体系淋洗，收集淋洗液，收集旋蒸产物。产物用7mL甲醇溶解，按2倍物质的量加入2MNaOH溶液，40℃下加热，水解完全后，用6M的HCl调节pH到2。将反应液用50mL乙酸乙酯萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠（按10%有机相体积的量加入），加入后磁力搅拌1h。过滤，旋蒸干。得到式I所述化合物。在壬基酚半抗原的基础上构建所得的壬基酚抗原也属于本专利技术的保护范围。所述壬基酚抗原，为将所述壬基酚半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。所述壬基酚抗原的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述壬基酚抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述壬基酚半抗原（式I）与载体蛋白偶联，获得所述壬基酚抗原。其中，所述壬基酚半抗原（式I）与所述载体蛋白偶联的摩尔比为14.8：1。在本专利技术中，所述壬基酚抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：（1）将所述壬基酚半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述壬基酚半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为20mg：1.5mL：21.5mg：13mg。（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5mL；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5mL；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5mL；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述壬基酚抗原。所述壬基酚半抗原（式I）或所述壬基酚抗原在定性或定量检测壬基酚中的应用也属于本专利技术的保护范围。利用所述壬基酚抗原制备的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。本专利技术所提供的壬基酚半抗原，以及所述壬基酚抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于壬基酚抗体的制备，以及壬基酚药物残留检测具有重大价值。附图说明图1为壬基酚半抗原质谱图。图2为BSA的MALDI-TOF-MAS图。图3为壬基酚-BSA复合物的MALDI-TOF-MAS图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、壬基酚半抗原的制备一、壬基酚半抗原的制备在壬基酚中加入二甲基甲酰胺（DMF）、氢化钠（NaH），所述壬基酚、DMF、NaH的配比为1000mg：30ml：50mg，室温反应15min获得反应液；在反应液中加入200mg4-溴丁酸乙酯，40℃油浴条件下反应，25ml乙酸乙酯萃取，蒸干，加入12mL乙酸乙酯将残留物溶解，称量2倍重量的硅胶加入其中，旋蒸干，准备硅胶柱上样。将混合好的硅胶样品使用干样加样法进行加样，用石油醚：乙酸乙酯体系淋洗，收集淋洗液，收集旋蒸产物。产物用7mL甲醇溶解，按2倍物质的量加入2MNaOH溶液，40℃下加热，水解完全后，用6M的HCl调节pH到2。将反应液用50mL乙酸乙酯萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠（按10%有机相体积的量加入），加入后磁力搅拌1h。过滤，旋蒸干。得到式I所述化合物。反应方程式如下：二、壬基酚半抗原的结构鉴定对所得壬基酚半抗原进行质谱检测（图1），结果显示其化学结构式如式I所示，即为壬基酚半抗原。式I实施例2、壬基酚人工抗原的制备及结构鉴定一、壬基酚人工抗原的制备1、免疫原的合成（1）将20mg壬基酚半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg溶解后再加入NHS13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取BSA50mg溶于3.5mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壬基酚半抗原，其结构为式I所示化合物：

【技术特征摘要】
1.一种壬基酚半抗原，其结构为式I所示化合物：式I。2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：在壬基酚中加入DMF、NaH，所述壬基酚、DMF、NaH的配比为1000mg：30ml：50mg，室温反应15min获得反应液；在反应液中加入200mg4-溴丁酸乙酯，40℃油浴条件下反应，25ml乙酸乙酯萃取，蒸干，加入12mL乙酸乙酯将残留物溶解，称量2倍重量的硅胶加入其中，旋蒸干，准备硅胶柱上样；将混合好的硅胶样品使用干样加样法进行加样，用石油醚：乙酸乙酯体系淋洗，收集淋洗液，收集旋蒸产物；产物用7mL甲醇溶解，按2倍物质的量加入2MNaOH溶液，40℃下加热，水解完全后，用6M的HCl调节pH到2；将反应液用50mL乙酸乙酯萃取，收集有机相，加入无水硫酸钠；过滤，旋蒸干，得到式I所述化合物。3.壬基酚抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。4.根据权利要求3所述的壬基酚抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。5.权利要求3或4所述的壬基酚抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述壬基酚抗原；权利要求1所述化合物与所述载体蛋白偶联的摩尔比为9.4：1。6.根据权利要求5所述的壬基...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立才，邵兵，丁亚芳，聂靖东，段莉莉，姚凯，李淑芳，王照鹏，刘薇，杨柳，秦誉，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11