一种表面固定双金属离子的磁性纳米材料的制备及应用制造技术

本发明专利技术述分析化学技术领域，涉及一种表面固定双金属离子的磁性纳米材料的制备及应用。本发明专利技术将两种金属离子同时固定在聚多巴胺包裹的磁性纳米结构材料表面，并以此为固相萃取材料，从蛋白酶解液中富集磷酸化肽，利用双金属离子对单磷酸化肽和多磷酸化肽富集的互补偏向性，实现对磷酸化肽的全面检测。本发明专利技术方法操作简单便捷，可以快速、高效地实现单磷酸化肽及多磷酸化肽的富集及质谱分析。

Preparation and Application of a Magnetic Nanomaterial with Surface Fixed Bimetallic Ions

【技术实现步骤摘要】
一种表面固定双金属离子的磁性纳米材料的制备及应用
本专利技术属分析化学
，涉及磷酸化肽的富集与纯化，具体涉及一种固定双金属离子的磁性纳米材料及其用于磷酸化肽富集的方法。
技术介绍
现有技术公开了有关富集方法被开发用于有效分离和纯化磷酸化肽，其中IMAC被认为是最强大和广泛使用的预处理策略之一。IMAC利用金属离子和磷酸基之间的亲和力，其中具有多个配位轨道的过渡金属离子用作最广泛使用的亲和探针。到目前为止，各种过渡金属离子，包括Ti4+，Fe3+，Ga3+，Cu2+，Zr4+等通过适当的螯合剂磷酸肽富集接枝到不同的载体材料上[Anal.Chem.78(2006)1574-1580.15-20；Anal.Chem.81(2009)94-104；J.ProteomeRes.5(2006)3114-3124；Anal.Chim.Acta.636(2009)34-41；AcsAppl.Mater.Interfaces.5(2013)13104-13112]，然而，大多数报道的IMAC材料都被单一金属离子功能化，通常不能满足全面磷酸化肽分析的需求。据报道，金属离子的Lewis酸度不同，金属离子固定的亲和探针对单/多磷酸肽表现出不同的富集偏好。在本申请的专利技术人之前的工作中，发现与Ti4+相比，Nb5+对多磷酸肽具有更好的富集效率[Anal.Chim.Acta.880(2015)67-76]。基于现有技术的研究基础，本申请拟提供一种固定双金属离子的磁性纳米材料及其用于磷酸化肽富集的方法。本申请中利用单/多磷酸肽富集倾向的互补性，合成二元金属离子IMAC材料，用于磷酸化肽的全面富集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术的研究基础，提供一种固定双金属离子的磁性纳米材料及其用于磷酸化肽富集的方法，所述的材料可利用双金属离子的单/多磷酸肽富集倾向的互补性，实现对磷酸化肽的全面检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：利用单/多磷酸肽富集倾向的互补性，合成二元金属离子IMAC材料，用于磷酸化肽的全面富集，其中包括：1，合成固定双金属离子磁性纳米材料：通过水热法合成四氧化三铁磁性材料，利用多巴胺碱性条件下的聚合反应，在磁球表面包裹一层聚多巴胺，在机械搅拌的作用下，金属离子均匀地固定在聚多巴胺层表面，得到固定双金属离子的聚多巴胺包裹的磁性纳米材料；本专利技术的实施例中，制备了四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4)：将FeCl3·6H2O溶解在乙二醇中，然后加入乙酸钠，将混合物在室温下保持搅拌以形成均匀溶液，然后转移到特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，将高压釜保持在200℃下16小时，冷却至室温后，用去离子水将生成的磁性颗粒冲洗数次，然后真空干燥；包裹聚多巴胺包裹的磁性纳米材料(Fe3O4@PDA)：将所获得的磁性颗粒分散在Tris缓冲液中，加入乙醇，随后，在连续搅拌下，向所得悬浮液中加入含有多巴胺盐酸盐的水溶液，并将混合物在室温下保持搅拌，所得产物用去离子水清洗几次，真空干燥；固定双金属离子磁性纳米材料(Fe3O4@PDA-Ti4+/Nb5+)：需要Fe3O4@PDA微球以加入草酸铌水合物和Ti(SO4)2的混合溶液中，两者均浓度为50mM，然后完全分散通过超声处理，室温搅拌4小时，最终用去离子水和乙醇彻底冲洗，并在真空中干燥以备待用。本专利技术中，所述的双金属离子为具有对单磷酸化肽和多磷酸化肽互补的富集偏向性的两种金属离子。本专利技术中，所合成的磷酸化肽富集材料的载体为聚多巴胺包裹的磁性纳米结构材料，尺寸为100～250nm。本专利技术中，通过水热法合成四氧化三铁磁性材料，利用多巴胺碱性条件下的聚合反应，在磁球表面包裹一层聚多巴胺，在机械搅拌的作用下，双金属离子均匀地固定在聚多巴胺层表面。本专利技术提供了基于固定双金属离子的磁性纳米材料用于磷酸化肽富集的方法，其特征在于，以双金属离子为固相萃取材料，实现对蛋白酶解液中的磷酸化肽的选择性富集。本专利技术的实施例中，合成的固定双金属离子磁性纳米材料用于磷酸化肽的全面富集，其富集过程为磁性材料固相萃取，具体包括：(1)制备的IMAC材料，用缓冲液清洗3次后，重新分散到缓冲液中；(2)向体系中加入适量蛋白酶解液，混匀；(3)采用磁性分离，收集下层固体相；(4)采用缓冲液冲洗下层固体相3次，每次清洗去除上清，收集材料；(5)加入氨水洗脱得到磷酸化肽，取洗脱液与基质溶液混合，进行MALDI-TOFMASS检测。本专利技术中，所述步骤(1)与(4)的缓冲液由50％乙腈和0.1％TFA组成。本专利技术中，.所述步骤(1)的材料分散后的浓度为0.1～1μg/μl。本专利技术中，所述步骤(2)中材料与蛋白酶解液25℃混旋10～60分钟。本专利技术中，所述步骤(5)中加入5μl氨水(0.4M)，25℃混旋5～20分钟，进行洗脱。本专利技术中，采用固定双金属离子磁性纳米材料对标准化蛋白中磷酸化肽的选择性富集，结果显示，固定双金属离子的磁性纳米材料对β-酪蛋白酶解液中的单磷酸化肽和多磷酸化肽均表现很好的富集效果。本专利技术中，采用固定双金属离子磁性纳米材料对实际样品中磷酸化肽的选择性富集，结果显示，固定双金属离子的磁性纳米材料对脱脂牛奶酶解液中的单磷酸化肽和多磷酸化肽均表现很好的富集效果。本专利技术具有如下优点：(1)固定双金属离子磁性纳米材料具有较高的磁响应性，可利用磁性分离，收集材料，具有操作简单、方便快速等特点。(2)利用双金属离子在单/多磷酸肽富集倾向上的互补性，实现单/多磷酸化肽的全面检测。附图说明图1为Fe3O4@PDA-Ti4+/Nb5+微球(a)扫描电镜图和(b)透射电镜图。图2为β-酪蛋白胰蛋白酶解液中磷酸化肽段的MALDI-TOF质谱图，其中，(a)Fe3O4@PDA-Ti4+微球，(b)Fe3O4@PDA-Nb5+微球，(c)Fe3O4@PDA-Ti4+和Fe3O4@PDA-Nb5+微球的物理混合物，(d)Fe3O4@PDA-Ti4+/Nb5+微球，其中“*”表示磷酸化肽段峰，“#”表示去磷酸化碎片峰。图3为脱脂牛奶胰蛋白酶解液中磷酸化肽段的MALDI-TOF质谱图，其中，(a)Fe3O4@PDA-Ti4+微球，(b)Fe3O4@PDA-Nb5+微球，(c)Fe3O4@PDA-Ti4+和Fe3O4@PDA-Nb5+微球的物理混合物，(d)Fe3O4@PDA-Ti4+/Nb5+微球，其中“*”表示磷酸化肽段峰，“#”表示去磷酸化碎片峰。具体实施方式下面的实例是对本专利技术提出的基于固定双金属离子磁性纳米材料的磷酸化肽富集方法的进一步说明。实施例1合成固定双金属离子磁性纳米材料：通过水热法合成四氧化三铁磁性材料，利用多巴胺碱性条件下的聚合反应，在磁球表面包裹一层聚多巴胺，在机械搅拌的作用下，金属离子均匀地固定在聚多巴胺层表面，得到固定双金属离子的聚多巴胺包裹的磁性纳米材料；(1)制备四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4)：将1.35gFeCl3·6H2O溶解在75mL乙二醇中，然后加入3.6g乙酸钠，将混合物在室温下保持搅拌以形成均匀溶液，然后转移到200mL特氟隆内衬的不锈钢高压釜中，将高压釜保持在200℃下16小时，冷却至室温后，用去离子水将生成的磁性颗粒冲洗数次，然后真空干燥；(2)包裹聚多巴胺包裹的磁性纳米材料(Fe3O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于固定双金属离子的磁性纳米材料用于磷酸化肽富集的方法，其特征在于，以双金属离子为固相萃取材料，实现对蛋白酶解液中的磷酸化肽的选择性富集。

【技术特征摘要】
1.一种基于固定双金属离子的磁性纳米材料用于磷酸化肽富集的方法，其特征在于，以双金属离子为固相萃取材料，实现对蛋白酶解液中的磷酸化肽的选择性富集。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的双金属离子为具有对单磷酸化肽和多磷酸化肽互补的富集偏向性的两种金属离子。3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所合成的磷酸化肽富集材料的载体为聚多巴胺包裹的磁性纳米结构材料，尺寸为100～250nm。4.按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述的固定双金属离子的磁性纳米材料通过水热法合成四氧化三铁磁性材料，利用多巴胺碱性条件下的聚合反应，在磁球表面包裹一层聚多巴胺，在机械搅拌的作用下，双金属离子均匀地固定在聚多巴胺层表面。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述富集的过程为磁性材料固相萃取，其包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嫣，江洁冰，孙雪妮，佘晓健，李佳佳，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31