无血清悬浮培养型MDCK细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种无血清悬浮培养型MDCK细胞株及其应用，所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK‑XF03，保藏编号为：CCTCC NO：C2018191；所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株可应用于流感疫苗和禽流感疫苗的生产。本发明专利技术通过无血清适应培养和悬浮培养驯化，得到了无血清悬浮培养型MDCK‑XF03细胞株，犬肾细胞MDCK‑XF03细胞在无血清培养基悬浮培养活力高、结团少且均一性较好，完全适应在无血清培养基中进行悬浮培养，为我国开展流感和禽流感疫苗的相关研究和生产提供了无血清悬浮培养型细胞株。

【技术实现步骤摘要】
无血清悬浮培养型MDCK细胞株及其应用
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种无血清悬浮培养型MDCK细胞株及其应用。
技术介绍
流感即流行性感冒(Influenza)，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病，禽流感(BirdFlu或AvianInfluenza)是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，人感染禽流感后的死亡率在33％以上。目前为止无论是流感还是禽流感均未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。流感疫苗和禽流感疫苗传统的生产工艺是鸡胚培养法，这种以鸡胚作为生产基质的方式已使用多年，工艺自然很成熟，但是该生产方式仍存在很多缺陷，如生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。鉴于此，WHO于1995年提出使用哺乳动物传代细胞替代鸡胚作为流感疫苗的生产基质，相对于鸡胚，动物细胞经复苏后可以快速增殖并进入规模化疫苗生产，而且生产过程操作简单且易于控制，能保证疫苗质量和安全，采用传代细胞将不受鸡胚等天然因素的限制，如遇疫情会快速反应，短时间内可提供大量疫苗供应市场。MDCK细胞(Madin-DabyCanineKidneyCells，MDCK)由Madin和Darby于1958年从美国CockerSpaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的最适合流感病毒培养的细胞系之一。目前国际上已有批准利用MDCK细胞生产的流感疫苗，而我国作为流感疫苗和禽流感疫苗的生产和使用大国，全国有13家流感疫苗生产企业，年产值超过百亿元，其全部为鸡胚工艺生产；禽流感疫苗中仅有2家采用MDCK细胞生产，分别是山东信得动物疫苗有限公司(兽药临字153122307)和吉林冠界生物技术有限公司(兽医生字070372306)，但是MDCK细胞基质生产的禽流感疫苗的批签发数很少，2018年全国禽流感疫苗总批签发数为1683批，其中，MDCK细胞基质为68批，仅占总批数的4％，还有很大提升空间。疫苗是用病毒制备的生物制品，人工获得大量病毒的方法主要有动物接种、鸡胚培养和细胞培养三种增殖方法，但是细胞培养是目前公认的最经济、快速和安全的病毒增殖方法。近年来，生物反应器大规模细胞技术的快速发展，与传统转瓶和细胞工厂培养相比表现出了明显优势，用生物反应器培养细胞和增殖病毒已成为疫苗生产工艺的首选。生物反应器培养细胞有微载体培养、片状载体培养、低血清悬浮培养和无血清悬浮培养等方式，其中，微载体培养和片状载体培养属贴壁培养方式，培养基中需要加动物血清，而且在工艺放大时有技术困难，国内目前最大的单罐培养体积还不到500L。低血清悬浮培养和无血清悬浮培养的方式其培养规模放大容易，目前国内BHK21细胞和MDCK细胞悬浮培养单罐体积可达6000L，而且还可以线性放大。无论是微载体培养、片状载体培养，还是低血清悬浮培养，因培养基中含有动物来源的血清成份对疫苗接种者有副反应和其它安全风险，所以，无血清悬浮培养是疫苗生产最青睐的工艺。MDCK细胞原始的细胞为贴壁培养型细胞，需要添加血清才能正常生长。流感疫苗/禽流感疫苗无血清悬浮培养工艺的难点是将原始的含血清贴壁培养型细胞系驯化为无血清悬浮培养型细胞株。
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中指出的现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种无血清悬浮培养型MDCK细胞株，该细胞株可应用于流感疫苗和禽流感疫苗的生产中。本专利技术的第一个目的是提供一种无血清悬浮培养型MDCK细胞株，对ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞系(CCL-34，P55)通过驯化得到了无血清悬浮培养型MDCK细胞株，所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：C2018191，分类命名为：犬肾细胞MDCK-XF03，保藏日期为：2018年9月20日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本专利技术的第二个目的是提供上述保藏编号为：CCTCCNO：C2018191的无血清悬浮培养型MDCK细胞株在流感疫苗和禽流感疫苗生产中的应用。作为优选，所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株作为细胞基质用于流感疫苗和禽流感疫苗生产。作为优选，所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株作为细胞基质对流感和禽流感病毒培养时，无血清悬浮培养型MDCK-XF03细胞以1.0-2.0×106/mL密度接种培养。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过无血清悬浮培养驯化方法，得到了无血清悬浮培养型MDCK细胞株(分类命名：犬肾细胞MDCK-XF03，保藏编号CCTCCNO：C2018191)，该细胞株能够增殖流感和禽流感病毒，为我国开展流感疫苗和禽流感疫苗的相关研究和生产提供基础。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为MDCK细胞形态；其中，A.贴壁培养型(驯化前，10X)，B.悬浮培养型(驯化后，20X)；图2为悬浮培养型MDCK-XF03细胞株不同密度培养的生长曲线图；图3为悬浮培养型MDCK-XF03细胞株增殖流感和禽流感病毒的HA柱形图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1.材料1.1MDCK细胞株(CCL-34)，从ATCC引进，引进时细胞代次为P55，在ATCC的保藏号：60245139，在ATCC的冻存时间：2011-10-20，为贴壁培养型细胞。引进后按《药典》2010版的要求在培养至60代时建立主细胞库(编号为：MDCK-M-60)，冻存数量1560支；在培养至63代时建立了工作细胞库(编号为：MDCK-W-63)冻存数量1680支。MDCK-M-60和MDCK-W-63分别于2014年12月和2015年1月送检中国食品药品检定研究院检定，于2017年12月取得了细胞检验合格报告，报告编号分别为SH201702634和SH201702584。1.2DEME(high-glucous)培养基，Gibco，货号：02-5062EJ；SFM-MDCK无血清培养基，兰州百灵，货号为：CFM403；优级胎牛血清(FBS)，兰州民海。1.3胰蛋白酶，Gibco，货号：27250，使用时配制成0.25％(m/m)使用液；TrypLE胰蛋白酶替代物(1X)，Gibco，货号：12563-029。1.4流感病毒[A/California/7/2009(NYMCX-179A)、A/Texas/50/2012(NYMCX-223A)、B/Phuket/3073/2013(以下简称:B/P)和B/Brisbane/60/2008(NYMCBX-35)]由长春生物制品研究所有限责任公司从英国国家生物制品检定所(NIBSC)购买；重组禽流感病毒(H5亚型Re-5、H5亚型Re-6、H5亚型Re-10)由吉林冠界生物技术有限公司从哈尔滨兽医研究所购买，以上病毒均为疫苗生产株。1.5CO2培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清悬浮培养型MDCK细胞株，其特征在于，所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2018191，分类命名为：犬肾细胞MDCK‑XF03，保藏日期为：2018年9月20日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一种无血清悬浮培养型MDCK细胞株，其特征在于，所述无血清悬浮培养型MDCK细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：C2018191，分类命名为：犬肾细胞MDCK-XF03，保藏日期为：2018年9月20日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。2.一种如权利要求1所述的无血清悬浮培养型MDCK细胞株在流感疫苗和禽流感疫苗生产中的应用。3.如权利要求2所述的无...

【专利技术属性】
技术研发人员：马忠仁，乔自林，靳冬武，刘振斌，令世鑫，柏家林，王家敏，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62