一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法技术

本发明专利技术公开了一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，按照如下方法进行密度梯度离心：将不同浓度梯度的蔗糖溶液按照浓度从低至高的顺序依次垫加入试管底部，形成自上而下浓度依次增加的梯度液，在梯度液最上层缓慢加注粗囊泡重悬液，离心；其中所述蔗糖溶液是pH8.4～8.8的20mm Tris‑HCL蔗糖重水溶液，所述粗囊泡重悬液是将粗囊泡重悬于pH8.4～8.8的20mm Tris‑HCL水溶液中制得，该方法能显著提高提取产量，减少样本用量，并能大幅缩短提取耗时，与差速离心和超滤法结合能显著提高提取纯度，临床使用更简便、更可靠、更快捷。

【技术实现步骤摘要】
一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法
本专利技术属于生物医学
，涉及外囊泡分离提取技术，具体涉及一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法。
技术介绍
随着尿液细胞外囊泡的发现和研究，尿液已被视为一种能反映疾病动态的样本。细胞外囊泡是脂质膜结构的纳米颗粒，可分为三类：外泌体，微泡和凋亡小体。其形成机制分别为：多泡体与质膜融合释放外泌体；细胞膜出芽直接形成微泡；从垂死细胞中脱落的囊泡形成凋亡小体。外泌体直径为40～100nm，微泡的直径为100～1,000nm，通常比外泌体大，但较小的微泡与外泌体大小相似，凋亡小体尺寸不一(直径800～5,000nm)，外观各异，但通常比其他类型的细胞外囊泡大。在它们形成期间，尿液细胞外囊泡可以转移各种细胞特异性成分(蛋白质，脂质和核酸)到靶细胞。随着方法学研究越来越严谨，分离、纯化和表征方法的优化有了进一步的发展，细胞外囊泡用于治疗疾病已经受到了极大的关注，这些研究正促进着人们认识到尿液细胞外囊泡在肾脏病理和生理中充当重要媒介。细胞外囊泡的提取方法有试剂沉淀法、超离法、超滤法、层析排阻法和密度梯度离心法。试剂沉淀方法已经被较多研究证实其提取的纯度不高，而单纯使用超离法、超滤法或层析排阻法获得的提取物中也含有较多的杂蛋白和非囊泡核酸。同时，肾病患者尿液含有大量可溶性蛋白质，干扰尿液细胞外囊泡蛋白的检测，需要增加额外的提纯步骤去除可溶性蛋白质。目前，超离法结合密度梯度离心仍然是提取细胞外囊泡的最有效的方法，该方法提取的囊泡含有外泌体纯度较高，通常把密度梯度离心法提取的细胞外囊泡称为小细胞外囊泡。然而密度梯度离心耗时长，传统密度梯度离心至少需要14小时，阻碍了其临床应用。尿调素(也称为Tamm-Horsfall尿糖蛋白(THP))是一种只在髓袢升支粗段合成的膜蛋白，是生理条件下尿液中含量最丰富的蛋白质。除了干扰囊泡蛋白检测，尿调节素可以形成网状捕获尿液细胞外囊泡，改变小细胞外囊泡密度，使其在梯度液中分布不集中，从而降低了小细胞外囊泡的提取量和纯度。因此，为了进一步适应临床应用和科学研究的需要，需要开发一种针对尿液标本的小细胞外囊泡的改良密度梯度离心方法，既能高产量和高纯度的提取尿液中小细胞外囊泡，又能缩短提取时间，为临床和科研提取尿液小细胞外囊泡提供更实用、简便而又严谨可靠的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有尿液细胞外囊泡提取技术存在的样本用量大，提取时间长，提取产量低或纯度不高等问题，本专利技术提供的方法能显著提高提取产量，减少样本用量，并能大幅缩短提取耗时，与差速离心和超滤法结合能显著提高提取纯度，临床使用更简便、更可靠、更快捷。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，按照如下方法进行密度梯度离心：将不同浓度梯度的蔗糖溶液按照浓度从低至高的顺序依次垫加入试管底部，形成自上而下浓度依次增加的梯度液，在梯度液最上层缓慢加注粗囊泡重悬液，离心；其中所述蔗糖溶液是pH8.4～8.8的20mmTris-HCL蔗糖重水溶液，所述粗囊泡重悬液是将粗囊泡重悬于pH8.4～8.8的20mmTris-HCL水溶液中制得。本专利技术采用特定pH范围的20mmTris-HCL蔗糖重水溶液对粗囊泡进行密度梯度离心，与传统的提取方法，例如以某一浓度的蔗糖重水溶液垫法离心或者以PBS蔗糖重水溶液密度梯度离心等相比，该法能显著提高尿液中小细胞外囊泡的提取产量，并能减少样本使用量，临床制备和使用更为方便。作为本专利技术优选的实施方案，所述蔗糖溶液是pH8.6的20mmTris-HCL蔗糖重水溶液，所述粗囊泡重悬液是将粗囊泡重悬于pH8.6的20mmTris-HCL水溶液中制得。该碱性条件下，能减少TH蛋白聚集程度，从而减少其对胞外囊泡的捕获，保持囊泡的本来密度，使小细胞外囊泡集中于一段特定梯度层，以获得最大产量的小细胞外囊泡。作为本专利技术优选的实施方案，所述梯度液在试管中自上而下的浓度依次为5％、10％、20％、40％和60％，该浓度梯度有利于小细胞外囊泡在中间层的富集，有利于后续提取工作的进行。作为本专利技术优选的实施方案，所述离心是在25℃离心5小时。本专利技术与传统方法的区别在于，传统密度梯度离心需要在4℃离心至少14小时才能获得一定产量的小细胞外囊泡，而本专利技术由于采用了20mmTris-HCL蔗糖重水溶液，因此仅需要在25℃离心5小时就能获得更大产量的小细胞外囊泡，极大地缩短了提取耗时。应当理解，本专利技术所述25℃，允许在仪器设定的精度内有一定误差,一般误差为±2℃，在该波动范围内的温度也纳入本专利技术的保护当中。作为本专利技术优选的实施方案，所述粗囊泡是将尿液样品在常温下通过差速离心法提取获得。所述差速离心法是先以低速离心去除死亡的细胞和大的细胞碎片，再高速离心去除可溶性蛋白质、蛋白质聚集体及其他与细胞外囊泡共沉淀的杂质，从而分离得到微囊泡和外泌体，其方法是本领域技术人员所公知的。通常差速离心法是在4℃的低温条件下进行，而本专利技术将差速离心法和20mmTris-HCL蔗糖重水溶液密度梯度离心相结合时发现，在常温进行差速离心更有利于提高小细胞外囊泡的提取产量。本专利技术所述常温是指18～28℃。在常温下使用差速离心法是指在18～28℃进行差速离心。优选的，所述差速离心法具体为：常温下，将尿液样品以500g离心，去沉淀，上清液以2,000g离心，去沉淀，上清液以16,000g离心，去沉淀，上清液使用超速离心机以200,000g离心力离心1小时，得到沉淀物粗囊泡。作为本专利技术优选的实施方案，所述差速离心过程中获得的上清液经过超滤浓缩。超滤法是依靠超滤膜两侧的压力差作为动力来分离外泌体的方法，其方法是本领域技术人员所公知的。本专利技术申请人研究发现，差速离心法结合超滤法，能去除大量杂蛋白，在保证产量的同时提高小细胞外囊泡的纯度。作为本专利技术优选的实施方案，所述超滤是在100kd超滤管内超滤浓缩，可最大限度的获得高纯度的小细胞外囊泡。本专利技术还提供了一种更为具体的尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)差速离心法提取粗囊泡：常温下，将尿液样品以500g离心，去沉淀，上清液以2,000g离心，去沉淀，上清液加入100kd超滤管中，在2,000离心力下将上清液浓缩10倍，然后将浓缩后的液体以16,000g离心，去沉淀，上清液使用超速离心机以200,000g离心力离心1小时，得到沉淀物粗囊泡，将粗囊泡重悬于PH8.6的20mmTris-HCL水溶液中得到粗囊泡重悬液；(2)密度梯度离心提取小细胞外囊泡：使用平头针注射器依次向试管底部加注浓度5％、10％、20％、40％、60％的pH8.6的20mmTris-HCL蔗糖重水溶液各1ml，将粗囊泡重悬液缓慢加在已配置好的梯度液最上层，在25℃以110,000g离心力离心5小时后，梯度液自上而下分为12层，取出富集小细胞外囊泡的6、7、8、9层，分别加入超离管，使用pH8.6的20mmTris-HCL水溶液稀释至8ml，分别在4℃下200,000g离心1小时，得到沉淀物。上述改良提取方法以差速离心法结合超滤法提取粗囊泡，以20mmTris-HCL蔗糖重水溶液进行密度梯度离心，能获得最大纯度的小细胞外囊泡。综上，与现有技术相比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于按照如下方法进行密度梯度离心：将不同浓度梯度的蔗糖溶液按照浓度从低至高的顺序依次垫加入试管底部，形成自上而下浓度依次增加的梯度液，在梯度液最上层缓慢加注粗囊泡重悬液，离心；其中所述蔗糖溶液是pH8.4～8.8的20mm Tris‑HCL蔗糖重水溶液，所述粗囊泡重悬液是将粗囊泡重悬于pH8.4～8.8的20mm Tris‑HCL水溶液中制得。

【技术特征摘要】
1.一种尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于按照如下方法进行密度梯度离心：将不同浓度梯度的蔗糖溶液按照浓度从低至高的顺序依次垫加入试管底部，形成自上而下浓度依次增加的梯度液，在梯度液最上层缓慢加注粗囊泡重悬液，离心；其中所述蔗糖溶液是pH8.4～8.8的20mmTris-HCL蔗糖重水溶液，所述粗囊泡重悬液是将粗囊泡重悬于pH8.4～8.8的20mmTris-HCL水溶液中制得。2.根据权利要求1所述的尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于所述蔗糖溶液是pH8.6的20mmTris-HCL蔗糖重水溶液，所述粗囊泡重悬液是将粗囊泡重悬于pH8.6的20mmTris-HCL水溶液中制得。3.根据权利要求1所述的尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于所述梯度液在试管中自上而下的浓度依次为5％、10％、20％、40％和60％。4.根据权利要求3所述的尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于所述离心是在25℃离心5小时。5.根据权利要求1-4中任一项所述的尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于所述粗囊泡是将尿液样品在常温下通过差速离心法提取获得。6.根据权利要求5所述的尿液小细胞外囊泡的改良提取方法，其特征在于所述差速...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小中，陈青根，黄波，刘静，邹叶青，
申请(专利权)人：南昌大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：江西,36