一种利用蓝藻合成根皮素的方法技术

本本发明专利技术提供一种以“光合细菌”—蓝藻为底盘生物来合成根皮素的技术方法，主要步骤是在蓝藻细胞里外源表达4香豆酸‑辅酶A连接酶（4 coumarate Coenzyme A Ligase，4CL）和查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）这两个根皮素合成关键酶，以对羟基苯丙酸（或称根皮酸）为底物来催化生成根皮素，4CL催化一分子对羟基苯丙酸生成对羟基苯丙酰辅酶A，然后CHS催化3个分子的丙二酰辅酶A（malonyl coA）与一分子对羟基苯丙酰辅酶A合成一分子根皮素。本方法通过一种可以进行光合作用的微生物来生产根皮素，从而创造了一种原料便宜、设备简单、环境污染低、产量高的根皮素生物合成途径，符合绿色化生产的方向。

【技术实现步骤摘要】
一种利用蓝藻合成根皮素的方法
本专利技术属于根皮素的合成
，尤其涉及到一种利用蓝藻来生产根皮素的方法。
技术介绍
蓝藻(Cyanobacteria)是一类通过光合作用获取能量的细菌，又名蓝绿藻、蓝绿菌或蓝细菌，其形态结构简单，无固定细胞核，体内含有的藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白加上叶绿体蛋白使之呈现出蓝绿色。蓝藻是地球上最早出现的藻类，是最简单、最原始的单细胞生物，在漫长的进化过程中，蓝藻把地球变成氧化型地球，并被内吞成植物的叶绿体，可以认为蓝藻是最简单的光合作用单位。由于蓝藻独特的能进行光合作用的生理特性，许多科学家将蓝藻看作一种“生物光反应器”，通过它将空气中的二氧化碳和水变成人类需要的化工产品和一些高价值的天然产物。对蓝藻进行基因改造来生物合成这些产品具有许多优势：（1）目前许多常见蓝藻的基因组，如聚球藻、集胞藻、鱼腥藻等，都已经被测序完毕，同时由于蓝藻的基因组小、结构简单，科学家已经专利技术了一套针对蓝藻细胞的成熟、易操作的基因编辑体系；（2）相对于高等动植物，蓝藻具有微生物生长快速的特点，适于进行产品的大规模生产操作；（3）蓝藻的适应能力很强，能在很多恶劣环境中生存，同时蓝藻需要的生存条件非常简单，甚至只需阳光和水分就能存活，因此在大规模培养时不仅能大幅度节省原料成本，而且不需要占用耕地资源，避免了和生产食物粮食等竞争土地资源的冲突。（4）蓝藻通过光合作用吸收空气中的二氧化碳并产生氧气排放到空中，因此大规模培养蓝藻能有效地缓解人类不断使用化石原料等造成的“温室效应”，起到一定的环保作用。所以使用蓝藻作为合成生物学中的底盘生物，具有广大的前景和巨大的价值。根皮素英文名称：Phloretin；分子式：C15H14O5；化学名称：3-(4-羟基苯基)-1-(2、4、6-三羟基苯基)-1-丙酮；CAS：60-82-2；分子量：274.28；物理性质：易溶于甲醇、乙醇和丙酮，微溶于氯仿、难溶于水、石油醚和苯。根皮素是国外新近研究开发出来的一种新型天然皮肤美白剂，主要分布于苹果、梨等多汁水果的果皮及根皮。根皮素能抑制皮脂腺的过度分泌，用于治疗分泌旺盛型粉刺；能抑制黑色素细胞活性，对各种皮肤色斑有作用。与同类天然成分熊果苷和曲酸相比，同等浓度的根皮素对酪氨酸酶的抑制作用要好于它们，并且当其与熊果苷和/或曲酸进行复配时，能大大提高产品对酪氨酸酶的抑制率，使抑制率达到100%。据最新研究发现其还有抗炎、免疫抑制，心血管保护等作用。全球每年用量不少于20吨，需求每年以20%速率增加，具有较大市场需求。目前，市场上根皮素的生产主要是通过化工合成，有的以根皮苷粗品为原料，经过简单纯化根皮苷，再在强路易斯酸和金属催化拖糖元和结晶重结晶得到根皮素。还有的以柚皮苷为原料，兰尼镍为催化剂，在氢氧化钠溶液中，催化氢化10小时合成柚皮苷二氢查耳酮，然后在85℃-95℃下的盐酸溶液中，柚皮苷二氢查耳酮水解2小时得到根皮素。这些化工法合成根皮素存在效率低、化学废液的排放、严重污染环境等问题。现在也有开发一些利用大肠杆菌或酿酒酵母等发酵来生物合成根皮素的方法，虽然这些生物合成法解决了产量低和部分环境污染等问题，但由于生产过程中的原料、设备及水电等成本太高，无法实现大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用蓝藻合成根皮素的生物合成方法，具有产量高、无污染、生产周期短、成本低且环保的优点。一种利用蓝藻合成根皮素的方法，将4香豆酸-辅酶A连接酶基因（4CL）以及查尔酮合成酶基因（CHS），导入蓝藻细胞得到重组蓝藻细胞，利用重组蓝藻细胞进行光合作用得到根皮素。优选地，所述蓝藻为聚球藻SynechococcuselongatusPCC7942。该合成方法具体包括以下步骤：构建整合载体NSI：选取所述SynechococcuselongatusPCC7942基因组上的基因序列段，且该段基因序列的改变不会影响SynechococcuselongatusPCC7942整个基因组的功能，以此来构建并获得整合载体NSI;重组载体：根据SynechococcuselongatusPCC7942细胞密码子偏好性优化基因4CL和CHS的密码子，然后将这两个基因插入到载体NSI上，得到带有氯霉素抗性基因的重组载体NSI-CHS-4CL；同源重组：将重组载体NSI-CHS-4CL转化入SynechococcuselongatusPCC7942细胞内，通过同源重组作用，将CHS和4CL两个基因整合到SynechococcuselongatusPCC7942基因组上的NSI基因位点，并以诱导型启动子Trc来控制基因的表达。筛选确认：以氯霉素来筛选转化NSI-CHS-4CL载体后的SynechococcuselongatusPCC7942单克隆细胞，然后提取该细胞基因组，通过PCR分子鉴定试验确定最终携带有4CL基因和CHS基因的SynechococcuselongatusPCC7942。优选地，所述4CL根据向日葵中基因的氨基酸序列进行合成。优选地，所述CHS根据灯盏花中基因的氨基酸序列进行合成。本专利技术生产根皮素与现有技术的不同之处在于：1）以蓝藻为底盘生物进行改造合成根皮素，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低；2）以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制；3）本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要要少，操作简单，易于产业转化；4）本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高；5）合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本专利技术工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。附图说明图1为本专利技术中外源基因整合示意图；图2为本专利技术中NSI质粒图谱；图3为本专利技术中重组载体NSI-CHS-4CL质粒图谱图4为本专利技术中根皮素生物合成路线图；图5为野生型Syn7942的液相结果图图6为本专利技术中实施例的液相结果图；图7为本专利技术中实施例的质谱图。具体实施方式为了使得本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本公开实施例的附图，对本公开实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本公开的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。本专利技术公开了一种利用蓝藻合成根皮素的方法，包括在蓝藻细胞里外源表达4香豆酸-辅酶A连接酶（4coumarateCoenzymeALigase，4CL）和查尔酮合成酶（Chalconesynthase，CHS）这两个根皮素合成关键酶，以对羟基苯丙酸（又称根皮酸）为底物来催化生成根皮素，4CL催化一分子对羟基苯丙酸生成对羟基苯丙酰辅酶A，然后CHS催化3个分子的丙二酰辅酶A（malonylcoA）与一分子对羟基苯丙酰辅酶A合成一分子根皮素，主要包括构建整合载体NSI、重组载体、同源重组、筛选确认、催化合成以及检测六个步骤。利用该合成方式，以蓝藻为底盘生物进行改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用蓝藻合成根皮素的方法，其特征在于，将4香豆酸‑辅酶A连接酶基因（4CL）以及查尔酮合成酶基因（CHS），导入蓝藻细胞得到重组蓝藻细胞，利用重组蓝藻细胞催化对羟基苯丙酸得到根皮素。

【技术特征摘要】
1.一种利用蓝藻合成根皮素的方法，其特征在于，将4香豆酸-辅酶A连接酶基因（4CL）以及查尔酮合成酶基因（CHS），导入蓝藻细胞得到重组蓝藻细胞，利用重组蓝藻细胞催化对羟基苯丙酸得到根皮素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蓝藻为聚球藻SynechococcuselongatusPCC7942。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建整合载体NSI：选取所述SynechococcuselongatusPCC7942基因组上的基因序列段，且该段基因序列的改变不会影响SynechococcuselongatusPCC7942整个基因组的功能，以此来构建并获得整合载体NSI;重组载体：根据SynechococcuselongatusPCC7942细胞密码子偏好性优化基因4CL和CHS的密码子，然后将这两个基因插入到载体NSI上，得到带有氯霉素抗性基因的重组载体NSI-CHS-4CL；同源重组：将重组载体NSI-CHS-4CL转化入SynechococcuselongatusPCC7942细胞内，通过同源重组作用，将CHS和4CL两个基因整合到SynechococcuselongatusPCC7942基因组上的NSI基因位点，并以诱导型启动子Trc来控制基因的表达；筛选确认：以氯霉素来筛选转化NSI-CHS-4CL载...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒿飞，朱文博，陈贤情，夏文豪，杨月，王筱，王文，杨慧，江会峰，
申请(专利权)人：嘉兴欣贝莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33