一种脱氧胆酸修饰的纳米复合物及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种脱氧胆酸修饰的纳米复合物及其制备与应用，本发明专利技术首先采用碳二亚胺缩合反应制备脱氧胆酸‑低分子壳聚糖共轭物，然后通过离子交联法制备脱氧胆酸修饰的低分子壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米复合物。该纳米复合物包封率和载药量较高，分别为(90.7±0.73)％和(6.5±0.29)％；体外释药具有pH敏感性，且可通过转运体‑配体的相互作用显著提高Caco‑2细胞的摄取率(提高2倍)；药动学实验表明该纳米复合物可显著提高RH的口服吸收，有效实现大黄酸的口服递送。本发明专利技术纳米复合物的制备方法简单易行，DOCA的修饰可使该纳米复合物与小肠胆酸转运体有效结合而被上皮细胞高效摄取，有利于提高药物的口服吸收。

Preparation and application of a deoxycholic acid modified Nanocomposite

The invention discloses a deoxycholic acid modified nanocomposite and its preparation and application. First, the deoxycholic acid low molecular chitosan conjugate is prepared by carbodiimide condensation reaction, and then the deoxycholic acid modified low molecular chitosan/carboxymethyl chitosan nanocomposite is prepared by ion cross-linking method. The encapsulation efficiency and drug loading of the nanocomposites were (90.7 (+0.73)% and (6.5 (+0.29)% respectively. The drug release in vitro was pH sensitive, and the uptake rate of Caco_2 cells was significantly increased by the interaction of transporter and ligand (twice). Pharmacokinetic experiments showed that the nanocomposites could significantly improve the oral absorption of RH and effectively realize the oral delivery of rhein. The preparation method of the nanocomposite is simple and feasible. The modification of DOCA can effectively bind the nanocomposite with small intestinal cholic acid transporter and be efficiently absorbed by epithelial cells, which is conducive to improving oral absorption of drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种脱氧胆酸修饰的纳米复合物及其制备与应用(一)
本专利技术涉及一种中药难溶性活性成分的负载方法，特别涉及一种脱氧胆酸-低分子壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米复合物及其在提高小肠上皮细胞摄取效率，增加药物口服吸收中的应用。(二)
技术介绍
低分子壳聚糖(lowmolecularweightchitosan，LMWC)是一种广泛用于纳米粒制备的生物可降解材料。然而LMWC作为一种阳离子聚合物，用于口服递送极易受到胃酸环境的破坏而导致药物突释及漏释。羧甲基壳聚糖(CMCs)为一种阴离子聚合物，可以与低分子壳聚糖通过静电吸附自组装形成具有pH响应特性的纳米复合物，从而能够避免胃酸低pH环境的降解，维持纳米粒在胃肠道中的稳定性。并且纳米复合物还可更好地控制所负载药物的释放。但由于亲水性的纳米复合物与细胞膜的亲和力较差，故仍在一定程度上限制了其用于药物的口服递送。小肠顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)能够将内源性小分子胆汁酸从肠细胞顶侧转移到细胞质，以维持肠肝胆汁酸循环。研究报道，脱氧胆酸(DOCA)及其衍生物与纳米复合物结合后，能够在一定程度上增强其疏水性，从而改善纳米复合物在肠壁上的通透性，并能有效地与ASBT相互作用，从而增加药物的口服吸收。本专利技术首先将脱氧胆酸与低分子壳聚糖进行结合，再与羧甲基壳聚糖通过静电吸附自组装形成纳米复合物(Nanocomplex,NCs)，包裹大黄酸(RH)后形成大黄酸：脱氧胆酸-低分子壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米复合物(RH:DOCA-LMWC/CMCsNCs)，用于大黄酸的口服递送。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种新型的脱氧胆酸修饰的低分子壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米复合物(DOCA-LMWC/CMCsNCs)，利用脱氧胆酸(DOCA)与小肠顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)结合的特性，实现纳米复合物从小肠上皮顶侧向基底侧的转运，从而促进中药难溶性活性成分大黄酸(RH)的口服吸收。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种脱氧胆酸修饰的纳米复合物，即脱氧胆酸修饰的低分子壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米复合物(DOCA-LMWC/CMCsNCs)，所述纳米复合物按如下方法制备：(1)脱氧胆酸的活化：在搅拌条件下，将脱氧胆酸(DOCA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，室温(25-30℃)下搅拌反应2～4h(优选2h)，获得活化的脱氧胆酸；所述DOCA与EDC、NHS的物质的量之比为1:2:2；所述二甲基亚砜的体积用量以脱氧胆酸重量计为3ml/31mg；(2)脱氧胆酸-低分子壳聚糖共轭物(DOCA-LMWC)的合成：在搅拌条件下，向低分子壳聚糖(LMWC)溶液中加入步骤(1)活化后的脱氧胆酸，室温(25-30℃)反应20～30h(优选24h)后于去离子水中透析2～5天(优选3天，透析袋的截留分子量为3500Da)，取截留液冻干(优选-50℃冷冻干燥48h)后，得白色的DOCA-LMWC共轭物；所述低分子壳聚糖溶液是将低分子壳聚糖溶于体积浓度90％DMSO水溶液制成浓度为12g/L的溶液；所述活化后的脱氧胆酸用量以脱氧胆酸羧基物质的量计，所述低分子壳聚糖用量以低分子壳聚糖氨基物质的量计，所述脱氧胆酸羧基与低分子壳聚糖氨基物质的量之比为1:2～4；(3)脱氧胆酸修饰的纳米复合物的制备：在搅拌条件下，将羧甲基壳聚糖(CMCs)水溶液滴入步骤(2)制备的DOCA-LMWC醋酸溶液中，室温反应0.5～1h(优选25℃反应0.5h)，至溶液出现蓝色乳光，停止反应，获得脱氧胆酸修饰的纳米复合物(DOCA-LMWC/CMCs)；所述羧甲基壳聚糖(CMCs)水溶液浓度为3-6g/L(优选3g/L)；所述DOCA-LMWC醋酸溶液是将DOCA-LMWC溶于体积浓度0.2％醋酸水溶液制成浓度为3-6g/L(优选3g/L)的溶液；所述DOCA-LMWC与CMCs的质量比为1:0.5-3，优选1:1。进一步，步骤(1)所述脱氧胆酸的活化按如下步骤进行：在搅拌条件下，将脱氧胆酸溶于二甲基亚砜，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下搅拌反应2～4h，获得活化的脱氧胆酸；其中二甲基亚砜总的用量以脱氧胆酸重量计为3ml/31mg，优选用于溶解脱氧胆酸的二甲基亚砜与溶解EDC和NHS的二甲基亚砜体积比为2:1。本专利技术还提供一种所述脱氧胆酸修饰的纳米复合物在制备药物载体中的应用，所述的应用方法为：将大黄酸(RH)溶于0.01MNaOH水溶液中，于搅拌下滴入脱氧胆酸修饰的纳米复合物中，室温反应0.5～1h，获得载有大黄酸的纳米复合物；所述脱氧胆酸修饰的纳米复合物体积用量以大黄酸质量比为4～6L/g。所述NaOH水溶液中大黄酸浓度为0.5g/L。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术首先采用碳二亚胺缩合反应制备脱氧胆酸-低分子壳聚糖共轭物(DOCA-LMWC)，然后通过离子交联法制备脱氧胆酸修饰的低分子壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米复合物。该纳米复合物包封率和载药量较高，分别为(90.7±0.73)％和(6.5±0.29)％；体外释药具有pH敏感性，且可通过转运体-配体的相互作用显著提高Caco-2细胞的摄取率(提高2倍)；药动学实验表明该纳米复合物可显著提高RH的口服吸收，有效实现大黄酸的口服递送。本专利技术纳米复合物的制备方法简单易行，DOCA的修饰可使该纳米复合物与小肠胆酸转运体有效结合而被上皮细胞高效摄取，有利于提高药物的口服吸收。(四)附图说明图1为DOCA(a)、LMWC(b)、DOCA-LMWC(c)的紫外光谱图。图2为DOCA、LMWC、DOCA-LMWC的红外光谱图。图3为DOCA、LMWC、DOCA-LMWC的1H-NMR图。图4为RH:LMWC/CMCsNCs(1)和RH:DOCA-LMWC/CMCsNCs(2)的粒径分布图(1a，2a)，Zeta电位图(1b，2b)和TEM图(1c，2c)。图5为RH:LMWC/CMCsNCs(A)和RH:DOCA-LMWC/CMCsNCs(B)的体外释放图。图6为空白载体与Caco-2细胞孵育共48h后的细胞存活率示意图(n＝3)。图7为Caco-2细胞对纳米复合物的细胞摄取特性图；(A)Caco-2细胞与FITC标记的纳米复合物共孵育2h后的激光共聚焦图。蓝色:DAPI染色的细胞核,绿色:FITC。(B)Caco-2细胞与FITC标记的纳米复合物共孵育2h后的流式分析图(n＝3)(**P<0.01vsLMWC/FITC-CMCsNCs)。(C)牛磺胆酸(TCA)预孵育后Caco-2细胞对纳米复合物摄取的流式分析图(n＝3)(##P<0.01vs100μMTCA,**P<0.01vs50μMTCA)。图8为大鼠灌胃给予RH、RH:LMWC/CMCsNCs和RH:DOCA-LMWC/CMCsNCs后血药浓度-时间曲线(n＝6)。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术室温是指25-30℃。本专利技术所用低分子壳聚糖的分子量为5000Da。实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脱氧胆酸修饰的纳米复合物，其特征在于所述纳米复合物按如下方法制备：(1)脱氧胆酸的活化：在搅拌条件下，将脱氧胆酸、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中，室温下搅拌反应2～4h，获得活化的脱氧胆酸；(2)脱氧胆酸‑低分子壳聚糖共轭物的合成：在搅拌条件下，向低分子壳聚糖溶液中加入步骤(1)活化后的脱氧胆酸，室温反应20～30h后去离子水透析2～5天，取截留液冻干后，得脱氧胆酸‑低分子壳聚糖共轭物；所述低分子壳聚糖溶液是将低分子壳聚糖溶于体积浓度90％二甲基亚砜水溶液制成；(3)脱氧胆酸修饰的纳米复合物的制备：在搅拌条件下，将羧甲基壳聚糖水溶液滴入步骤(2)制备的脱氧胆酸‑低分子壳聚糖共轭物醋酸溶液中，室温反应0.5～1h，获得脱氧胆酸修饰的纳米复合物。

【技术特征摘要】
1.一种脱氧胆酸修饰的纳米复合物，其特征在于所述纳米复合物按如下方法制备：(1)脱氧胆酸的活化：在搅拌条件下，将脱氧胆酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜中，室温下搅拌反应2～4h，获得活化的脱氧胆酸；(2)脱氧胆酸-低分子壳聚糖共轭物的合成：在搅拌条件下，向低分子壳聚糖溶液中加入步骤(1)活化后的脱氧胆酸，室温反应20～30h后去离子水透析2～5天，取截留液冻干后，得脱氧胆酸-低分子壳聚糖共轭物；所述低分子壳聚糖溶液是将低分子壳聚糖溶于体积浓度90％二甲基亚砜水溶液制成；(3)脱氧胆酸修饰的纳米复合物的制备：在搅拌条件下，将羧甲基壳聚糖水溶液滴入步骤(2)制备的脱氧胆酸-低分子壳聚糖共轭物醋酸溶液中，室温反应0.5～1h，获得脱氧胆酸修饰的纳米复合物。2.如权利要求1所述脱氧胆酸修饰的纳米复合物，其特征在于步骤(1)所述二甲基亚砜用量以脱氧胆酸重量计为3ml/31mg。3.如权利要求1所述脱氧胆酸修饰的纳米复合物，其特征在于步骤(1)所述脱氧胆酸的活化按如下步骤进行：在搅拌条件下，将脱氧胆酸溶于二甲基亚砜，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的二甲基亚砜溶液中，室温下搅拌反应2～4h，获得活化的脱氧胆酸；所述二甲基亚砜总的用量以脱氧胆酸重量计为3ml/31mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏颖慧，罗静雯，陈丹飞，李范珠，孙蒋，姚文杰，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33