用于快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法技术

本发明专利技术发明专利技术了一种用于快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法，所述分子信标探针包括Beacon 1，Beacon2，Beacon3，Beacon4和Beacon5。本发明专利技术通过这5条探针全部覆盖对利福平耐药的rpoB基因的81个位点，从而检测利福平耐药的结核分枝杆菌。本发明专利技术中的分子信标探针检测灵敏度高，特异性强，能够快速特异地检测利福平耐药的结核分枝杆菌。本发明专利技术还公开了一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针的检测方法。

Molecular beacon probe for rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis and its detection method

The invention discloses a molecular beacon probe for rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis and a detection method thereof. The molecular beacon probe comprises Beacon 1, Beacon 2, Beacon 3, Beacon 4 and Beacon 5. The five probes cover 81 sites of rifampicin-resistant rpoB gene, thereby detecting rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis. The molecular beacon probe in the invention has high detection sensitivity and specificity, and can rapidly and specifically detect rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis. The invention also discloses a method for rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis molecular beacon probes.

【技术实现步骤摘要】
用于快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法
本专利技术涉及一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法，属于结核分枝杆菌检测

技术介绍
结核病是一种古老的疾病，严重危害人类的健康及发展。虽然抗结核药物的专利技术及临床应用在控制结核中发挥了重要作用，但形势仍不理想。随着耐药结核的广泛出现，使结核病的防控形势日益严峻。根据世界卫生组织发布的《2018年全球结核病报告》，中国位于全球结核病高负担国家的第二位，每年大约有新发结核病患者90万人。耐药结核病仍然是一项公共卫生危机和卫生安全威胁。据世卫组织统计，2017年有55.8万利福平耐药新发病例。利福平作为结核病化疗的一线药物，在短期化疗中起重要作用，同时利福平耐药性的检测也是判断耐多药结核病的标志。传统的基于培养的药敏检测模式，用于实际临床诊断治疗受到很大限制。现已证实结核分枝杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基编码基因rpoB的突变有关，其中95％的突变都发生在rpoB上的507-533密码子(共81bp)利福平耐药决定区(rifampinresistancedeterminingregion，RRDR)上，通过检测RRDR区突变，就可以给出耐药信息。现有检测结核分枝杆菌利福平耐药的技术主要有两大类：基于培养的药敏检测和基于核酸的分子生物学检测。基于培养的药敏检测的主要缺点是，耗时长，首先需要在分离培养的基础上进行结核分枝杆菌鉴定，此过程需要4-8周的时间，然后再此基础上进行后续的传统固体比例法(4-8周)或者液体药敏(1-2周)的时间，而且进行活菌操作，对人和环境不安全。而基于核酸的分子生物学检测为代表的有荧光定量PCR熔解曲线，其结果判读需要看熔解峰的峰型及Tm值，这加大了基层实验工作人员的难度，不易在基层推广使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法。技术方案为达到上述专利技术目的，本专利技术提供了一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的五条分子信标探针，其序列分别如下：SEQIDNO.15’-FAM-GCTACGGAGCCAATTCATGGACCAGACGTAGC-DAB-3’SEQIDNO.25’-HEX-CCACGGCGCTTGTGGGTCAACGTGG-DAB-3’SEQIDNO.35’-TEXRED-CCGACGCCGACAGCGGGTTGTTCGTCGG-DAB-3’SEQIDNO.45’-FAM-CGAGCTCAGCTGGCTGGTGCGCTCG-DAB-3’SEQIDNO.55’-TEXRED-CCTGCCGACTGTCGGCGCTGGCAGG-DAB-3’本专利技术还提供了包含所述五种分子信标探针的耐利福平的结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR检测试剂，包括如下组分：分子信标探针Beacon1，Beacon2，Beacon3，Beacon4和Beacon5，以及PCR扩增上游引物rpoB-F和下游引物rpoB-R；所述上游引物rpoB-F和下游引物rpoB-R的序列如下所示：rpoB-F：5’-GGAGGCGATCACACCGCAGACGTT-3’rpoB-R：5’-ACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT-3’所述耐利福平结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测试剂，对于一个样品，需要A管和B管同时进行检测。对于A管，所述25μL检测试剂中，含有10μM上游引物rpoB-F，10μM下游引物rpoB-R，8μM分子信标探针Beacon1，8μM分子信标探针Beacon2，8μM分子信标探针Beacon3。对于B管，所述25μL检测试剂中，含有10μM上游引物rpoB-F，10μM下游引物rpoB-R，8μM分子信标探针Beacon4和8μM分子信标探针Beacon5。本专利技术最后还提供了利用所述检测试剂实时荧光定量PCR检测耐利福平的结核分枝杆菌方法，包括以下步骤：将待检测基因样本与PCRMix以及所述检测试剂混合，放置在实时荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用Touchdown的程序，具体为：Touchdown循环程序：94℃10S，66℃15S(每个循环下降1℃)，72℃15S，共10个循环；接着40个循环，94℃10S，56℃30S(同时进行FAM、HEX和TEXRED三种荧光检测)，72℃15S。所述仪器为实时荧光定量PCR仪。一种耐利福平的结核分枝杆菌分子信标探针的检测方法，包括如下步骤：(1)模板DNA的制备：提取待检样品的DNA，所述待检样品是疑似为含有结核分枝杆菌的痰液样品或者分离的结核分枝杆菌；(2)实时荧光定量PCR扩增反应：对于一个样品，准备A和B两管，在25μLPCR管配制反应体系：对于A管，上游引物rpoB-F1μL，下游引物rpoB-R1μL，Beacon10.8μL，Beacon20.8μL，Beacon30.8μL，模板DNA5μL，PCRMix12.5μL，用灭菌去离子水补充到25μL。对于B管，上游引物rpoB-F1μL，下游引物rpoB-R1μL，Beacon40.8μL，Beacon50.8μL，模板DNA5μL，PCRMix12.5μL，用灭菌去离子水补充到25μL。(3)PCR扩增程序：Touchdown循环程序：94℃10S，66℃15S(每个循环下降1℃)，72℃15S，共10个循环；接着40个循环，94℃10S，56℃30S(同时进行FAM、HEX和TEXRED三种荧光检测)，72℃15S。(4)结果判断：如果A管和B管中一共有5条曲线出现，说明该样品为结核分枝杆菌，且对利福平敏感；如果A管和B管中的任何一条或者两条曲线不出现扩增曲线，则证明为结核分枝杆菌，但对利福平耐药；如果A管和B管中没有任何一条扩增曲线出现，表明该样品不是结核分枝杆菌。本专利技术的有益效果在于：本专利技术检测耐利福平的结核分枝杆菌的鉴定方法简单，快速，只需要一个半小时即可判断样品是否对利福平耐药，同时还能检测样品是否为结核分枝杆菌；灵敏度高，最低可检测出100个菌/mL的结核分枝杆菌；特异性强，本专利技术设计了5条分子信标探针，全部覆盖了与利福平耐药相关的rpoB基因的81个位点，检测特异性高。本专利技术对于临床利福平耐药结核分枝杆菌的诊断对临床医生的用药具有参考价值，适合推广使用。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。根据结核分枝杆菌rpoB基因突变位点，设计了5条特异性分子信标探针，序列分别如下：SEQIDNO.15’-FAM-GCTACGGAGCCAATTCATGGACCAGACGTAGC-DAB-3’SEQIDNO.25’-HEX-CCACGGCGCTTGTGGGTCAACGTGG-DAB-3’SEQIDNO.35’-TEXRED-CCGACGCCGACAGCGGGTTGTTCGTCGG-DAB-3’SEQIDNO.45’-FAM-CGAGCTCAGCTGGCTGGTGCGCTCG-DAB-3’SEQIDNO.55’-TEXRED-CCTGCCGACTGTCGGCGCTGGCAGG-DAB-3’包含所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法，其特征在于，所述分子信标探针包括Beacon1、Beacon2、Beacon3、Beacon4和Beacon5，所述Beacon1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述Beacon2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述Beacon3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述Beacon4的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，所述Beacon5的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法，其特征在于，所述分子信标探针包括Beacon1、Beacon2、Beacon3、Beacon4和Beacon5，所述Beacon1的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述Beacon2的碱基序列如SEQIDNO.2所示，所述Beacon3的碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述Beacon4的碱基序列如SEQIDNO.4所示，所述Beacon5的碱基序列如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述Beacon1的5’端用FAM标记，Beacon2的5’端用HEX标记，Beacon3的5’端用TEXRED标记，Beacon4的5’端用FAM标记，Beacon5的5’端用TEXRED标记，所述Beacon1、Beacon2、Beacon3、Beacon4和Beacon5的3’端用相同的荧光猝灭基团DAB标记。SEQIDNO.15’-FAM-GCTACGGAGCCAATTCATGGACCAGACGTAGC-DAB-3’SEQIDNO.25’-HEX-CCACGGCGCTTGTGGGTCAACGTGG-DAB-3’SEQIDNO.35’-TEXRED-CCGACGCCGACAGCGGGTTGTTCGTCGG-DAB-3’SEQIDNO.45’-FAM-CGAGCTCAGCTGGCTGGTGCGCTCG-DAB-3’SEQIDNO.55’-TEXRED-CCTGCCGACTGTCGGCGCTGGCAGG-DAB-3’3.根据权利要求2所述的不同荧光标记的分子信标探针，将Beacon1，Beacon2和Beacon3放入一P...

【专利技术属性】
技术研发人员：马彩霞，畅志强，
申请(专利权)人：北京岱美仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11