靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和在制备肝癌治疗药物中的应用，通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平，为肝癌的治疗提供了EGFL9基因这一作用靶点；通过设计靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA序列、以及相应的siRNA表达质粒和siRNA慢病毒，从而能够高效抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，并因此能够有效抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，对于肝癌的EGFL9基因靶向治疗药物的制备意义重大；同时可用于相应RNAi、单克隆抗体及小分子拮抗剂等靶向治疗药物的开发，从而为针对EGFL9开发治疗肝癌的靶向治疗药物提供了一种行之有效的方法。

Construction and application of siRNA, siRNA plasmid and lentivirus targeting EGFL9 gene expression

The invention discloses a siRNA, siRNA plasmid, lentivirus targeting to inhibit the expression of EGFL9 gene and its construction method and application in the preparation of therapeutic drugs for hepatocellular carcinoma. By studying the expression level of EGFL9 in hepatocellular carcinoma tissues, the target of EGFL9 gene is provided for the treatment of hepatocellular carcinoma; siRNA sequence targeting to inhibit the expression of EGFL9 gene and corresponding siRNA expression plasmids are designed. Granules and siRNA lentiviruses can effectively inhibit the expression of EGFL9 gene in hepatocellular carcinoma cells, and thus effectively inhibit the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells, which is of great significance for the preparation of EGFL9 gene-targeted therapeutic drugs for hepatocellular carcinoma; at the same time, they can be used for the development of targeted therapeutic drugs such as corresponding RNAi, monoclonal antibodies and small molecular antagonists, so as to develop and treat hepatocellular carcinoma with EGFL9. Targeted therapy for cancer provides an effective method.

【技术实现步骤摘要】
靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和在制备肝癌治疗药物中的应用。
技术介绍
肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC；简称肝癌)现居我国恶性肿瘤发病率的第四位，其年死亡率已达23.31/10万，高居国内恶性肿瘤死亡率的第二位，严重威胁我国人民的生命健康。尽管近年来肝癌手术切除率已明显提高，肝癌的治疗手段已趋于多样化，肝移植也越来越多地用于肝癌的治疗，但肝癌的整体治疗水平目前仍无显著改善，术后5年生存率长期徘徊在30％左右。究其原因，主要在于肝癌术后极高的复发转移率。目前，肝癌术后5年内的复发/转移率仍高达70～80％，严重地制约着肝癌远期生存率的提高。因此，侵袭转移的调控机制一直都是肝癌研究的重点之一。累积的研究显示，肝癌的侵袭转移是一个多步骤、序贯的生物学过程，牵涉到许多复杂的生物学、病理学事件，包括肿瘤细胞的脱落、运动迁移、细胞粘附、血管生成及免疫逃逸等诸多环节，但细胞侵袭迁移能力的提高是导致肿瘤突破内皮细胞屏障并发生远处转移的关键环节，故而已有大量研究都集中于肝癌细胞侵袭迁移能力的调控。然而，目前的研究仍未完全阐明调控肝癌细胞侵袭迁移的分子机制，因而尚未开发出可有效抑制肝癌复发转移的药物，从而严重制约了肝癌病人长期生存率的进一步提高。可见，继续寻找在肝癌侵袭迁移中发挥重要作用的分子并阐明其作用机制，对于研发抑制肝癌复发转移的靶向治疗措施均非常重要。EGFL9基因(表皮生长因子样9结构域，又称DLK2)属于EGFL家族成员，其定位于人染色体6p21.1，大小为6,281bp。EGFL9基因编码的蛋白大小为40.5kDa，属于跨膜糖蛋白，在人体组织中有着范围较广的表达谱，在肺脏、大脑、脂肪、睾丸、成人肝脏、胎盘、卵巢和胸腺组织中都有表达。早期的研究显示，EGFL9在脂质生成过程中发挥重要作用。近来的研究则发现，EGFL9基因的突变与进展期前列腺癌相关，这首次提示EGFL9可能参与恶性肿瘤的发生发展过程。还有研究发现EGFL9可通过抑制Notch1信号通路从而抑制SK-MEL-2转移性黑色素瘤细胞的增殖，最新的研究还发现，针对小鼠EGFL9(DLK2)的疫苗可以降低小鼠模型中肾癌的生长，提示EGFL9是一个潜在的肿瘤治疗靶点。然而迄今为止，EGFL9在肝癌等恶性肿瘤中的表达水平及其在恶性肿瘤侵袭转移过程中的作用均尚无任何研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和在制备肝癌治疗药物中的应用，通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平、设计人EGFL9基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，以慢病毒介导siRNA的方法，特异性抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，从而实现抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。本专利技术通过实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌组织及细胞系中的表达水平，以及通过免疫组织化学技术检测EGFL9蛋白在肝癌组织中的表达水平，首次证明EGFL9基因在肝癌组织及细胞系中的表达明显上升，且EGFL9的表达上调与肝癌的多结节、包膜侵犯、静脉侵犯及较晚的TNM分期等临床病理特征密切相关，而侵袭转移潜能越高的肝癌细胞系中的EGFL9表达量也越高；同时，首次发现抑制EGFL9基因的表达可明显抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，证明EGFL9可作为肝癌治疗的一个有效作用靶点。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术提供的一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA，所述siRNA序列为5’-CTGTGAGGTAAATGTGGATGA-3’(序列1)。本专利技术提供的一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA质粒，包括含有上述siRNA序列的双链DNAoligo；所述双链DNAoligo的正义链序列为5’-CCGGCTGTGAGGTAAATGTGGATGATTCAAGAGATCATCCACATTTACCTCACAGTTTTTG-3’(序列2)，反义链序列为5’-AATTCAAAAAGGTGGCAAGACCTGTGAGCTTTCTCTTGAAAAGCTCACAGGTCTTGCCACC-3’(序列3)，其两端含有AgeI和EcoRI酶切位点粘端。本专利技术提供的一种靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒，包括上述siRNA质粒以及慢病毒包装载体；并且其构建方法包括以下步骤：(1)siRNA质粒的构建(1-1)以AgeI和EcoRI限制性内切酶作用于GV248载体以使其线性化，电泳鉴定其酶切片段，得到线性化的GV248质粒；(1-2)通过T4DNA连接酶将所述线性化的GV248质粒和纯化好的权利要求2所述双链DNAoligo连接，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞，以连接转化产物长出菌溶于LB培养基作为模板进行PCR鉴定；(1-3)PCR鉴定采用的引物为：上游：5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’(序列4)；下游：5’-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3’(序列5)；对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有EGFL9干扰片段的siRNA质粒；(2)干扰慢病毒的构建以所述siRNA质粒作为表达载体，Helper1.0和Helper2.0慢病毒包装辅助质粒作为慢病毒包装载体，同时共转染293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，即为包含所述siRNA质粒的干扰慢病毒。本专利技术还提供了上述靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒在制备肝癌治疗药物中的应用；以及包括上述靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒或干扰慢病毒的药物组合物。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平，为肝癌的治疗提供了EGFL9基因这样一个非常有效的作用靶点；设计了靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA序列、siRNA表达质粒及siRNA慢病毒，该siRNA慢病毒能够高效抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，并因此能够有效抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，对于肝癌的EGFL9基因靶向治疗药物的制备意义重大；同时可用于相应RNAi、单克隆抗体及小分子拮抗剂等靶向治疗药物的开发，从而为针对EGFL9开发治疗肝癌的靶向治疗药物提供了一种行之有效的方法。附图说明下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步的详细描述：图1是GV248质粒DNA图谱；图2是Helper1.0质粒DNA图谱；图3是Helper2.0质粒DNA图谱；图4是实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌组织中表达量的结果示意图(A：EGFL9基因在20例肝癌及相应癌旁肝组织中的表达量；B：肝癌及癌旁肝组织中EGFL9基因表达量的比较)；图5是实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌细胞系及正常肝细胞系中表达量的结果示意图；图6是免疫组织化学法检测EGFL9蛋白在肝癌组织及相应癌旁肝组织中表达水平的结果示意图(A-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA序列为5’‑CTGTGAGGTAAATGTGGATGA‑3’(序列1)。

【技术特征摘要】
1.一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA序列为5’-CTGTGAGGTAAATGTGGATGA-3’(序列1)。2.一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA质粒，其特征在于：包括含有权利要求1所述siRNA序列的双链DNAoligo；所述双链DNAoligo的正义链序列为5’-CCGGCTGTGAGGTAAATGTGGATGATTCAAGAGATCATCCACATTTACCTCACAGTTTTTG-3’(序列2)，反义链序列为5’-AATTCAAAAAGGTGGCAAGACCTGTGAGCTTTCTCTTGAAAAGCTCACAGGTCTTGCCACC-3’(序列3)，其两端含有AgeI和EcoRI酶切位点粘端。3.一种靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒，其特征在于：包括权利要求2所述siRNA质粒以及慢病毒包装载体。4.权利要求3所述靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)siRNA质粒的构建(1-1)以AgeI和EcoRI限制性内切酶作用于GV248载体以使其线性化，电泳鉴定其酶切片段，得到线性化的GV248质粒；(1-2)通过T4DNA连接酶将所述线性化的GV248质粒和纯化好的权利要求2所述双链DNAoligo连接，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴帆，王百林，严伦，戴丽冰，
申请(专利权)人：广州市红十字会医院暨南大学医学院附属广州红十字会医院，
类型：发明
国别省市：广东,44