一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用技术

本申请公开了一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法，包括以下步骤：①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(XM_003245847.3)选取RNAi的靶标区域，并利用Primer5.0设计靶标区域的PCR扩增引物；②、提取豌豆蚜的总RNA并通过反转录过得cDNA，然后用扩增引物对cDNA中含有海藻糖酶基因进行PCR扩增，纯化产物获得目的基因；③、扩增含T7promoter序列的双链目的DNA，然后利用试剂盒合成双链RNA。

Preparation and Application of RNA Interference Sequence of Trehalase Gene of Pea Aphid

This application discloses a method for preparing RNA interference sequence of trehalase gene of pea aphid, including the following steps: (1) selecting the target region of RNAi according to the trehalase sequence of pea aphid (XM_003245847.3) and designing the PCR amplification primers of the target region using Primer 5.0; (2) extracting the total RNA of pea aphid and retranscribing the DNA, then using the amplified primers to contain the DNA. The trehalase gene was amplified by PCR and purified to obtain the target gene. Thirdly, the double-stranded target DNA containing T7 promoter sequence was amplified, and then the double-stranded RNA was synthesized by the kit.

【技术实现步骤摘要】
一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用
本申请属于病虫防治领域，具体涉及一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法及应用。
技术介绍
豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)属同翅目(Homoptera)蚜科(Aphididae)，在世界各地广泛分布，是许多豆科作物及牧草的主要害虫之一。在我国西北苜蓿种植区，豌豆蚜每年可造成苜蓿生产10％～30％的经济损失。豌豆蚜危害植物时，以刺吸式口器吸取植物韧皮部汁液，从而影响植物的生长发育，开花结果等正常生命活动，危害严重时造成整株植物死亡。豌豆蚜可以作为植物病毒的传播者，可以传播苜蓿花叶病毒，豌豆耳突花叶病毒等25种病毒。由于豌豆蚜繁殖力强，发生代数多，生态适应性强等原因，对蚜虫的防治至关重要。由于化学杀虫剂的高频率和高浓度的等不合理使用，污染生态环境，危害人类和牲畜健康。为了探索新的防治方法对于减少农药污染，提高牧草产量与品质具有重要意义。海藻糖作为昆虫血糖，几乎存在于昆虫的所有组织和器官中。主要分布在脂肪体、肠道、血液、卵巢甚至在腿部肌肉也有合成。海藻糖不仅作为能源和碳源，而且作为蛋白质和细胞膜的稳定器、作为敏感化合物或生长调节器和昆虫细胞壁的结构组成的前体物，对昆虫的生存与死亡起着决定性的重要作用。海藻糖对昆虫的生长发育和蜕皮变态过程发挥着重要作用，如昆虫迁飞、取食行为、免疫抗性、越冬和滞育等。海藻糖可以通过浓度的高低调节味觉感受器和中枢神经系统从而影响昆虫对食物的选择和取食行为。海藻糖酶对豌豆蚜体内海藻糖分解和几丁质合成中都有重要作用。海藻糖突变体造成昆虫体内海藻糖累积，提高死亡率和影响取食行为。抑制海藻糖酶的活性，显著抑制昆虫的生长，造成蜕皮困难和大幅度增加死亡率。过量海藻糖、葡萄糖影响几丁质代谢，显著增加昆虫畸形和死亡率，高海藻糖比低海藻糖的对昆虫影响大。可见，海藻糖酶在维持昆虫体内海藻糖平衡和几丁质合成中有重要作用，海藻糖酶的活性对昆虫的生长发育十分重要。RNAi是Fireetal在1998年阐述双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)能引发生物体同源序列mRNA降解而最终导致特异性基因转录后沉默的效应，由于主要作用于转录之后，所以又称RNAi为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)。随后陆续在斑马鱼、果蝇、锥虫、拟南芥和大小鼠中也发现了RNAi现象。RNAi技术作为基因沉默的工具，已被广泛应用于基因功能研究、基因治疗和病毒防治等方面，也为农作物害虫防治提供了新的策略。RNAi技术在害虫方面的运用还处于初级阶段，并且存在很多挑战，如如何进入昆虫体内和在昆虫体内快速降解等问题。随着RNAi技术的成熟，RNAi技术广泛应用于植物病虫害防治，以及保护经济昆虫等，2007年首次报道了高表达dsRNA的农作物防治农业害虫。昆虫体内海藻糖酶也有两种形式可溶性海藻糖酶(TRE1)和结合型藻糖酶(TRE2)，海藻糖酶作为水解海藻糖和几丁质合成的起始酶，不仅影响几丁质合成而且与昆虫生长发育和繁殖都有着密切联系。在昆虫体内TRE1基因较高表达与表皮和马氏管，TRE2主要表达与脂肪体和中肠。沉默甜菜夜蛾TRE基因表达，显著影响几丁质合成还影响昆虫的变态发育与飞行。TRE在昆虫生长发育中起重要作用。利用RNAi来验证其功能，有利于为今后海藻糖相关靶向药物和转dsRNA基因植物提供很好理论依据。
技术实现思路
本申请提供了一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法，该方法包括以下步骤：①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(XM_003245847.3，由3大国际数据库NCBI提交的序列)选取RNAi的靶标区域，并利用Primer5.0设计靶标区域的PCR扩增引物：正义链5’-3’GGCGTGGTTTGACTGGGATA反义链5’-3’CAACCAAAACCTGTCTGCGG；②、提取豌豆蚜的总RNA并通过反转录过得cDNA，然后用扩增引物对cDNA中含有海藻糖酶基因进行PCR扩增，纯化产物获得目的基因；③、对①中的特异性引物5’-端加上T7promoter序列：TRE-1：TAATACGACTCACTATAGGGGGCGTGGTTTGACTGGGATATRE-2：TAATACGACTCACTATAGGGCAACCAAAACCTGTCTGCGG，用于扩增含T7promoter序列的双链目的DNA，然后利用试剂盒合成双链RNA。进一步地，将上述制得的双链RNA溶解到蚜虫人工饲料中饲喂豌豆蚜，获得RNAi的豌豆蚜。进一步地，上述步骤③中的试剂盒为TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit试剂盒。本专利技术还提供了通过上述制备方法制备得到的豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列在防治豌豆蚜中的应用。附图说明图1带有T7promoter序列的DNA片段；其中：M，DNAMarkerDL2000；1，PCR扩增的绿色荧光蛋白(GFP)基因片段；2，PCR扩增的GFP基因片段；3，PCR扩增的TRE基因片段；4，PCR扩增的TRE基因片段。图2目的双链RNA片段；其中：M，RiboRulerRNALadder；1，合成的dsGFP片段；2，合成的dsTRE片段。图3豌豆蚜TRE基因沉默水平；其中：Red-24h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；Red-48h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；Green-24h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；Green-48h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；dsGFP，为对照组；dsTRE，处理组；图4豌豆蚜海藻糖酶活性影响；其中：Red-24h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；Red-48h，红色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；Green-24h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食24小时的表达量；Green-48h，绿色型豌豆蚜转移到叶片取食48小时的表达量；图5RNAi对豌豆蚜繁殖的影响；其中：单头繁殖数，平均每雌产蚜数；图6RNAi对豌豆蚜表型的影响；其中：对照，正常表型；蜕皮困难，蜕皮失败产生的致死表型；图7取食行为的影响；其中：red-dsGFP，红色型豌豆蚜对照组；red-dsTRE，红色型豌豆蚜处理组；green-dsGFP，绿色型豌豆蚜对照组；green-dsTRE，绿色型豌豆蚜处理组。具体实施方式本申请结合以下实施例用于进一步描述技术方案，但这些实施例并非限制本申请的范围。实施例1：一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备及应用检测实验步骤：1dsRNA设计合成根据3大国际数据库NCBI提交的序列，海藻糖酶(XM_003245847.3)利用MEGA软件比对推断保守区域，利用软件Primer5.0设计特异性扩增引物，用于扩增豌豆蚜海藻糖合成酶和海藻糖酶保守区域基因。将扩增产物送往西安擎科测序，比对基因测序结果，引物序列如下：正义链5’-3’GGCGTGGTTTGACTGGGATA反义链5’-3’CAACCAAAACCTGTCTGCGG2.饲喂dsRNA对两种色型豌豆蚜死亡率，基因沉默水平，生命表参数，取食行为及海藻糖酶活性的影响将合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法，所述的方法包括以下步骤：①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(XM_003245847.3)选取RNAi的靶标区域，并利用Pri mer5.0设计靶标区域的PCR扩增引物：正义链5’‑3’GGCGTGGTTTGACTGGGATA反义链5’‑3’CAACCAAAACCTGTCTGCGG；②、提取豌豆蚜的总RNA并通过反转录过得cDNA，然后用扩增引物对cDNA中含有海藻糖酶基因进行PCR扩增，纯化产物获得目的基因；③、对①中的特异性引物5’‑端加上T7 promoter序列：TRE‑1：TAATACGACTCACTATAGGGGGCGTGGTTTGACTGGGATATRE‑2：TAATACGACTCACTATAGGGCAACCAAAACCTGTCTGCGG，用于扩增含T7 pro moter序列的双链目的DNA，然后利用试剂盒合成双链RNA。

【技术特征摘要】
1.一种豌豆蚜海藻糖酶基因的RNA干扰序列的制备方法，所述的方法包括以下步骤：①、根据豌豆蚜的海藻糖酶序列(XM_003245847.3)选取RNAi的靶标区域，并利用Primer5.0设计靶标区域的PCR扩增引物：正义链5’-3’GGCGTGGTTTGACTGGGATA反义链5’-3’CAACCAAAACCTGTCTGCGG；②、提取豌豆蚜的总RNA并通过反转录过得cDNA，然后用扩增引物对cDNA中含有海藻糖酶基因进行PCR扩增，纯化产物获得目的基因；③、对①中的特异性引物5’-端加上T7promoter...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广，张克信，张艳蕾，刘长仲，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62