一种鼠李糖乳杆菌及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体公开了一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14568。本发明专利技术公开的鼠李糖乳杆菌接种至酒糟中后，其可以利用酒糟中的糖类等物质为基础，进行乳酸发酵，乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解，因此，接种在酒糟中的鼠李糖乳杆菌可以在酒糟贮存中良好生长，并抑制酒糟贮存过程中霉菌等杂菌生长繁殖，从而实现酒糟原料贮存过程中营养组分的最大保持。

A Lactobacillus rhamnosus and its screening method and Application

The invention relates to the field of microbial technology, and specifically discloses a Lactobacillus rhamnosus, whose storage number is CGMCC No. 14568 at the General Microbial Center of the China Microbial Species Preservation Commission. The Lactobacillus rhamnosus inoculated in distiller's grains can ferment lactic acid on the basis of sugar and other substances in distiller's grains. Lactic acid has strong bactericidal ability, can effectively inhibit the activities of harmful microorganisms and the rapid decomposition of organic matter. Therefore, Lactobacillus rhamnosus inoculated in distiller's grains can grow well in storage and inhibit the decomposition of organic matter. During the storage of distiller's grains, fungi and other miscellaneous fungi grow and multiply, so as to achieve the maximum retention of nutrient components in the storage of distiller's grains.

【技术实现步骤摘要】
一种鼠李糖乳杆菌及其筛选方法和应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌及其筛选方法和应用。
技术介绍
随着我国白酒技术的发展，白酒的年产量逐渐提高，作为白酒生产的副产物——酒糟的产量也越来越大，酒糟的再利用已成为白酒行业亟需解决的问题。近年来，我国白酒的年产量已经达到500-600万吨，白酒糟的产量更高达2100万吨。酒糟的妥善处理将直接影响到白酒生产企业的可持续发展，同时也关系到相关的国家节粮和环保政策的推广与落实。酒糟含有丰富的氨基酸、维生素和多种微量元素等，营养比较丰富，但其含水率高，如不加以处理，极易霉变腐败变质，这样不仅浪费了宝贵的资源，还会对周边的环境造成严重污染。因此，酒糟的再利用对我国废弃资源再利用和环境保护都具有十分重大的意义。酒糟资源化方式中，厌氧消化技术是处理百万吨级酒糟最实用的技术途径之一。但由于酿酒工艺的自身要求，酒糟会大规模集中产生，考虑的建设成本等诸多问题，厌氧消化工艺无法短时间内消纳完集中产生的酒糟，为了保证厌氧消化工程发酵原料的可持续供应，酒糟需要一段时间贮存。目前，酒糟的主要贮存方式为自然堆放，但是自然堆放的酒糟容易霉变腐败，造成有机质损失严重，灰分增高；不仅如此，自然贮存过程中经历一系列生化反应，在一定程度上改变了其结构和成分，不利于后续厌氧消化的进行。
技术实现思路
本专利技术的第一目的就是针对现有技术存在的问题，提供一种能够用于酒糟贮存的鼠李糖乳杆菌，该菌可以作为生物添加剂单独接种于酒糟原料，改善酒糟的的贮存效果。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.14568，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期为：2017年08月25日。所述鼠李糖乳杆菌的16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示。具体的，所述的鼠李糖乳杆菌是从酒糟贮存场基地的渗滤液中分离纯化获得，渗滤液为酒糟原料贮存30天后，由贮存槽底部收集获得，具体酒糟贮存场的选择有很多。具体的，所述的鼠李糖乳杆菌为革兰氏阳性菌，菌株呈杆状，长1.2～2.5μm，宽0.6～1μm。本专利技术的第二目的是提供一种上所述的鼠李糖乳杆菌的筛选方法，其步骤如下：将采集的渗滤液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05mL，于MRS分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株。具体的方案为，所述MRS分离培养基的制作方法为：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20g，加水至1000mL，pH6.2-6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min。进一步的，鼠李糖乳杆菌的活化步骤为，将鼠李糖乳杆菌接种于活化培养基，在30～35℃、PH6.0～6.5的条件下培养46-48h；鼠李糖乳杆菌的发酵扩大培养步骤为：将活化的鼠李糖乳杆菌接种于发酵扩大培养基，在30℃、120rpm条件下振荡培养48h。具体的，所述活化培养基的制作方法为：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，补水至1000mL，pH6.2～6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min；所述发酵扩大培养基的制作方法为：称取蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖10g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，补水至1000mL，pH6.2～6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min。以上所述的活化培养基和发酵扩大培养基均为液体培养基，若采用固体培养则分别在两种液体培养基配方基础上额外增加1.0％～2.0％(W/V)的琼脂即可。本专利技术的第三目的是提出一种如上所述的鼠李糖乳杆菌在酒糟贮存中的应用。具体的，是将发酵扩大培养后的鼠李糖乳杆菌菌液按0.33％～0.66％(W/V)的比例均匀喷洒到酒糟中，压实排气，塑料薄膜覆盖，堆放于阴凉处，至少贮存6个月。本专利技术的鼠李糖乳杆菌接种至酒糟中后，其可以利用酒糟中的糖类等物质为基础，进行乳酸发酵，乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。因此，接种在酒糟中的鼠李糖乳杆菌可以在酒糟贮存中良好生长，占据有利生态位，抑制酒糟贮存过程中霉菌等杂菌生长繁殖，实现酒糟原料贮存过程中营养组分的最大保持。具体的试验结果表明，鼠李糖乳杆菌接种至酒糟中后能够显著降低酒糟中TS、VS、纤维素等的损失，具体应用时，鼠李糖乳杆菌可以采用直接接种指酒糟的方法(如喷洒到酒糟中)实现酒糟的原位贮存，操作简单、投入小。总体上来说，与现有技术相比，本专利技术公开的
技术实现思路
存在的有益效果是：(1)提供了一种新的鼠李糖乳杆菌属菌株；(2)公开的鼠李糖乳杆菌能够应用于酒糟贮存；(3)公开的鼠李糖乳杆菌是通过筛选得到，不会对周围环境及生态平衡造成危害，符合生物安全法规；(4)公开的鼠李糖乳杆菌贮存效果稳定，受温度影响小，在常温条件下也具有较好的贮存效果；(5)公开的鼠李糖乳杆菌仅须单一菌株即可应用于酒糟贮存，具有操作简单易行、无需配套设备与技术、投资规模小等优点。具体实施方式以下通过实施例1-3来进一步说明的本专利技术公开的技术方案。实施例1：鼠李糖乳杆菌株的筛选(1)MRS分离培养基的制作：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20g，加水至1000mL，pH6.5，在121℃下高温灭菌30min，待用。(2)收集贵州鸭溪镇一酒糟贮存场基地的渗滤液(任意一处酒槽贮存场都可以)，渗滤液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05mL，于MRS分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株，其性状特征如下：形态特征：该菌在MRS分离培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长1.2～2.5μm，宽0.6～1μm；在30℃培养2～3天形成芽孢，芽孢大小0.6～0.9×1～1.5μm，为长圆形或圆柱形。培养性质：该菌置于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板培养：在35℃下培养1天可大量生长，菌落表面凸起，乳白色，表面光滑无褶皱，菌落不透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，随着培养时间的增加变为淡黄色。分子生物学鉴定：提取该菌株全基因组DNA，PCR扩增16SrDNA片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。实施例2：培养基及接种菌液的制备1)活化培养基制备：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼠李糖乳杆菌，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14568。

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖乳杆菌，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.14568。2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌的16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌，其特征在于：其是从酒糟贮存场基地的渗滤液中分离纯化获得，渗滤液为酒糟原料贮存30天后，由贮存槽底部收集获得。4.根据权利要求3所述的鼠李糖乳杆菌，其特征在于：其为革兰氏阳性菌，菌株呈杆状，长1.2～2.5μm，宽0.6～1μm。5.一种如权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌的筛选方法，其步骤如下：将采集的渗滤液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05mL，于MRS分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株。6.根据权利要求5所述的鼠李糖乳杆菌的筛选方法，其特征在于：所述MRS分离培养基的制作方法为：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20g，加水至1000mL，pH6.2-6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：何荣玉，徐太平，胡兵，
申请(专利权)人：中节能绿碳环保有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11