一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，包括以下步骤：(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；(12)吸起磁力搅拌子A，淋洗后取下，置于24孔板培养孔中；(13)加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；(14)吸起磁力搅拌子A，淋洗后取下，置于24孔板的培养孔中自然风干；(21)加入结晶紫溶液染色，吸起磁力搅拌子A，淋洗后取下，置于24孔板的培养孔中自然风干；(22)加入无水乙醇脱色后转移至96孔板内，用酶标仪测定OD600nm。还公开了该方法在筛选变形链球菌生物膜抑制剂中的应用。本发明专利技术方法操作简单、成本低廉，且数据的稳定性与灵敏度高，具备良好的应用前景。

A Method for Detecting Biofilm Formation of Streptococcus Mutans and Its Application

The invention discloses a method for detecting the formation amount of Streptococcus mutans biofilm, which comprises the following steps: (11) incubating the magnetic agitator A in saliva; (12) absorbing the magnetic agitator A, removing it after washing, and placing it in a 24-well plate culture hole; (13) adding BHI liquid culture medium, Streptococcus mutans suspension and sample solution to be tested, and incubating again; (14) attracting the magnetic agitator A. (21) dyeing with crystal violet solution, attracting magnetic agitator A, then removing it after washing, and putting it in the culture hole of 24-well plate for natural air drying; (22) Transferring it into 96-well plate after decolorization with anhydrous ethanol, and measuring OD600 nm with enzyme label instrument. The application of this method in screening biofilm inhibitors of Streptococcus mutans is also disclosed. The method has the advantages of simple operation, low cost, high stability and sensitivity of data, and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法及应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法及应用。
技术介绍
龋病，俗称虫牙、蛀牙，是一种源于细菌性感染的口腔主要常见疾病，严重时可继发牙髓炎和根尖周炎，甚至会引起牙槽骨和颌骨炎症,作为一种普遍存在于儿童和成人中的慢性口腔传染病，其成因与变形链球菌(Streptococcusmutans)在牙齿表面的定殖有着密切的联系。现代医学研究认为，变形链球菌生物膜吸附其他细菌在牙釉表面所形成的牙菌斑也是致龋的关键因素之一，减少或抑制生物膜的形成同样可达到防治龋齿的目的。生物膜形成量的测定是开展研究工作与评价治疗效果的重要手段，而目前测量生物膜的方法缺点有：灵敏度低、成本高，操作复杂、平行样本的数据重现性差。因此，寻找一种灵敏度高、成本低廉、操作简易、稳定性高的检测方法是当务之急。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，还提供了该检测方法在筛选变形链球菌生物膜抑制剂中的应用。具体的，提供了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，包括以下步骤：(1)变形链球菌生物膜的形成：(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；(12)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中；(13)向培养孔中加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；(15)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(2)变形链球菌生物膜的检测：(21)向培养孔中加入结晶紫溶液染色完全后，用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗去除多余的染色液，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(22)向培养孔中加入无水乙醇脱色，取200～300μL转移至96孔板内，用酶标仪测定OD600nm，即为量化后的变形链球菌生物膜形成量。进一步的，步骤(11)中，所述磁力搅拌子A的规格为5×10mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。进一步的，步骤(11)中，所述唾液取自正常人唾液且经过10000g离心12～18min及0.22μm滤膜过滤的无菌处理；所述孵育的温度为25～45℃，时间为2～6h。进一步的，步骤(12)中，所述磁力搅拌子B的规格为10×50mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。进一步的，步骤(12)中，所述PBS缓冲液的质量浓度为10mM，pH为7.0。进一步的，步骤(13)中，所述BHI液体培养基的加入量为1.5～2mL；所述变形链球菌菌悬液的浓度为104～108CFU/mL，加入量为100～300μL；所述待测样品溶液为菌悬液或无菌溶液，加入量为300～500μL。进一步的，步骤(13)中，所述孵育的方式为厌氧，温度为25～45℃，时间为12～36h。进一步的，步骤(21)，所述结晶紫溶液的浓度为1g/L，加入量为1.5～2mL；染色的时间为12～18min。进一步的，步骤(22)，所述无水乙醇的加入量为300～400μL；脱色时间为12～18min。第二方面，还提供了所述的变形链球菌生物膜形成量的检测方法在筛选变形链球菌生物膜抑制剂中的应用。上述技术方案中，首次披露了一种全新的变形链球菌生物膜形成量的检测方法，该方法有灵敏度高、数据重现性佳、成本低廉、操作简单的优点。并提供了该方法在筛选变形链球菌生物膜抑制剂中的应用，还方法具有良好的应用前景。具体实施方式为更清楚的对本专利技术技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本专利技术的技术方案进行进一步阐述：在一个具体的实施方式中，提供了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，包括以下步骤：(1)变形链球菌生物膜的形成：(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；(12)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中；(13)向培养孔中加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；(14)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(2)变形链球菌生物膜的检测：(21)向培养孔中加入结晶紫溶液染色完全后，用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗去除多余的染色液，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(22)向培养孔中加入无水乙醇脱色，取200～300μL转移至96孔板内，用酶标仪测定OD600nm，即为量化后的变形链球菌生物膜形成量。本专利技术检测方法选用磁力搅拌子A在唾液中孵育，是因为通过比较发现，链球菌生物膜在磁力搅拌子A表面的形成过程与生物膜在牙齿表面的形成类似；且磁力搅拌子A的表面积远远大于传统方法的底面积，因此有利于更真实地反映生物膜的形成量，表面积越小，受到的影响会越大；并且磁力搅拌子A带有磁性，在后续淋洗等操作过程中，通过另一个磁性物吸起来操作(吸起时的接触面小，对结果的影响忽略不计)，这样一来使淋洗效果更彻底，并且整个操作过程也更简单可靠。本申请在加入变形链球菌后，变形链球菌在磁力搅拌子A表面形成生物膜，通过结晶紫染色，能够对形成的生物膜充分染色，无水乙醇脱色后测定其OD600nm，本专利技术方法操作简单，且稳定性好，灵敏度更高。进一步的，步骤(11)中，所述磁力搅拌子A的规格为5×10mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。磁力搅拌子A优选为圆柱形，直径长度为5×10mm，能够完全置于24孔板的培养孔中。进一步的，步骤(11)中，所述唾液取自正常人唾液且经过10000g离心12～18min及0.22μm滤膜过滤的无菌处理；所述孵育的温度为25～45℃，时间为2～6h。选择在唾液中孵育是为了更好地模拟牙齿在口腔中的环境，在口腔中的牙齿周围通常都是包裹了唾液的。进一步的，步骤(12)中，所述磁力搅拌子B的规格为10×50mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。进一步的，步骤(12)中，所述PBS缓冲液的质量浓度为10mM，pH为7.0。这里使用缓冲液清洗的主要作用是将未能与生物膜结合的游离态结晶紫染料去除，这样就能确保最终测得的OD值为结合于生物膜上的结晶紫含量的真实体现。进一步的，步骤(13)中，所述BHI液体培养基的加入量为1.5～2mL；所述变形链球菌菌悬液的浓度为104～108CFU/mL，加入量为100～300μL；所述待测样品溶液为菌悬液或无菌溶液，加入量为300～500μL。这里，BHI液体培养基提供了变形链球菌生长繁殖所需的营养，加入的待测样品溶液对变形链球菌生物膜形成产生一定的影响。进一步的，步骤(13)中，所述孵育的方式为厌氧，温度为25～45℃，时间为12～36h。变形链球菌是厌氧菌，在厌氧条件下生长繁殖能力旺盛，而在好氧条件下其生长缓慢。进一步的，步骤(21)，所述结晶紫溶液的浓度为1g/L，加入量为1.5～2mL；染色的时间为12～18min。这里，结晶紫溶液为碱性染料，与生物膜中的核酸结合，把生物膜染成深色。进一步的，步骤(22)，所述无水乙醇的加入量为300～400μL，脱色时间为12～18mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)变形链球菌生物膜的形成：(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；(12)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中；(13)向培养孔中加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；(14)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(2)变形链球菌生物膜的检测：(21)向培养孔中加入结晶紫溶液染色完全后，用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗去除多余的染色液，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(22)向培养孔中加入无水乙醇脱色，取200～300μL转移至96孔板内，用酶标仪测定OD600nm，即为量化后的变形链球菌生物膜形成量。

【技术特征摘要】
1.一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)变形链球菌生物膜的形成：(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；(12)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中；(13)向培养孔中加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；(14)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(2)变形链球菌生物膜的检测：(21)向培养孔中加入结晶紫溶液染色完全后，用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗去除多余的染色液，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；(22)向培养孔中加入无水乙醇脱色，取200～300μL转移至96孔板内，用酶标仪测定OD600nm，即为量化后的变形链球菌生物膜形成量。2.根据权利要求1所述的变形链球菌生物膜形成量的检测方法，其特征在于，步骤(11)中，所述磁力搅拌子A的规格为5×10mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。3.根据权利要求1所述的变形链球菌生物膜形成量的检测方法，其特征在于，步骤(11)中，所述唾液取自正常人唾液且经过10000g离心12～18min及0.22μm滤膜过滤的无菌处理；所述孵育的温度为25～45℃，时间为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑨，吴正钧，刘振民，吴燕婷，王晓花，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31