编辑DNA甲基化的方法技术

本发明专利技术涉及修饰DNA甲基化的方法，所述方法是通过与和具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶和一个或多个指导序列接触来实现的。

Method of editing DNA methylation

The present invention relates to a method for modifying DNA methylation by contacting a site-specific nuclease with no catalytic activity fused with an effector substructure domain having methylation or demethylation activity and one or more guiding sequences.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编辑DNA甲基化的方法相关申请本申请要求2016年8月19日提交的美国临时申请序列号62/377,520的权益，该美国临时申请的内容在此以引用的方式整体并入本文。政府支持本专利技术是在政府支持下根据国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的基金号HD045022作出的。政府享有本专利技术的某些权利。
技术介绍
5-胞嘧啶处的哺乳动物DNA甲基化在许多生物过程中发挥关键的作用，包括基因组印记、细胞命运决定、染色质结构组织、细胞身份的维持以及基因表达的调节(Bird,2002；Cedar和Bergman,2012；Jaenisch和Bird,2003；Smith和Meissner,2013)。遗传研究已经揭示，DNA甲基化对于哺乳动物发育和对环境信号的适应来说是必要的(Jaenisch和Bird,2003；Li等,1992；Smith和Meissner,2013)。异常的DNA甲基化已经在癌症和神经病症中被观测到(Laird和Jaenisch,1996；Robertson,2005)。由于测序技术的进步，因此许多类型的人类和小鼠细胞和组织的单核苷酸分辨率甲基化图谱已经被描绘出(Lister等,2009；Schultz等,2015)。重要的是，这些图谱已经允许在正常发育(Lister等,2013)以及疾病(DeJager等,2014；Doi等,2009；Landau等,2014)的不同阶段期间以碱基对分辨率鉴定出差异甲基化区域(DMR)。然而，由于缺乏使得能够以靶向方式有效编辑DNA甲基化的适当分子工具，因此对这些DMR的功能意义的研究仍然是一项挑战。
技术实现思路
哺乳动物DNA甲基化是在许多生物过程中协调基因表达网络的表观遗传机制。然而，对特定甲基化事件的功能的研究仍然具有挑战性。已经证实，Tet1或Dnmt3a与无催化活性的Cas9(dCas9)的融合使得能够进行靶向DNA甲基化编辑。使dCas9-Tet1融合蛋白或dCas9-Dnmt3a融合蛋白靶向到甲基化的启动子序列或非甲基化的启动子序列分别引起内源性报告基因的激活或沉默。dCas9-Tet1对BDNF启动子IV或MyoD远端增强子进行的靶向脱甲基化分别诱导有丝分裂后神经元中的BDNF表达或激活MyoD，从而促进成纤维细胞重编程为成肌细胞。dCas9-Dnmt3a对CTCF环锚定位点进行的靶向从头甲基化阻断CTCF结合并且干扰DNA成环，从而引起相邻环中的基因表达改变。最终，证实这些工具可以在小鼠中编辑DNA甲基化，这表明了它们对于表观遗传调节的功能研究的广泛效用。这些工具将可用于深入了解DNA甲基化在诸如基因表达、细胞命运决定以及高阶染色质结构的组织的不同生物过程中的功能意义。此外，这些工具将可用于构建筛选平台以当与不同的sgRNA文库组合时鉴定功能上指定的差异甲基化区域(DMR)以及产生转基因小鼠以在体内研究特定DNA甲基化事件。本文公开了修饰细胞中的一个或多个基因组序列的方法，所述方法包括向所述细胞中引入与具有甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及一个或多个指导序列，从而修饰所述细胞中的一个或多个基因组序列。本文还公开了修饰细胞中的一个或多个基因组序列的方法，所述方法包括向所述细胞中引入与具有脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及一个或多个指导序列，从而修饰所述细胞中的一个或多个基因组序列。本文还公开了调节细胞中一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括向所述细胞中引入与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及指导序列或编码指导序列的核酸，从而调节细胞中一个或多个基因组序列的甲基化。在某些方面，所述基因组序列包括差异甲基化区域、增强子(例如MyoD的增强子)、启动子(例如BDNF启动子)或CTCF结合位点。在一些方面，所述效应子结构域包括Tet1。在其它方面，所述效应子结构域包括Dnmt3a。在一些方面，所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cas蛋白(例如Cas9蛋白或Cpf1蛋白)。所述指导序列可以是核糖核酸指导序列。在某些方面，所述指导序列具有约10个碱基对至约150个碱基对的长度。所述一个或多个指导序列可以包括两个或更多个指导序列。在一些实施方案中，在所述细胞中修饰2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个基因组序列。所述细胞可以是干细胞、神经元、有丝分裂后细胞或成纤维细胞。在一些方面，所述细胞是人类细胞或小鼠细胞。在一些方面，一个或多个核定位序列融合在所述无催化活性的位点特异性核酸酶与所述效应子结构域之间。在某些方面，所述基因组序列中的一个或多个与疾病或疾患有关。在某些方面，所述方法还包括使所述细胞与抑制或增强DNA甲基化的试剂接触。所述试剂可以是小分子。举例来说，所述试剂是5-氮杂胞苷或5-氮杂脱氧胞苷。在某些实施方案中，所述方法还包括将所述细胞引入非人类哺乳动物体内。所述非人类哺乳动物可以是小鼠。还公开了通过本文所述的方法产生的分离的修饰细胞。本文还公开了治疗有需要的患者的方法，所述方法包括将本文所述的修饰细胞向需要这样的细胞的患者施用。还公开了在有需要的个体中调节引起疾病的一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括向所述个体中引入与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及一个或多个指导序列，从而在所述个体中调节引起疾病的一个或多个基因组序列的甲基化。还公开了具有修饰的基因组的修饰细胞，所述修饰的基因组包含其中基因组序列的甲基化已经受到调节的第一基因组修饰，其中所述调节通过使细胞与和具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶和一个或多个指导序列接触而发生。本文还公开了调节细胞中一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括使所述细胞与编码包含与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶的多肽的核酸；以及指导序列或编码指导序列的核酸接触。本文还公开了在个体中调节一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括向所述个体施用编码包含与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶的多肽的核酸；以及指导序列或编码指导序列的核酸。在一些方面，所述指导序列使所述多肽靶向到所述一个或多个基因组序列。所述基因组序列可以包括差异甲基化区域、增强子、启动子或CTCF结合位点。在某些方面，所述方法包括调节细胞中至少两个基因组序列的甲基化，其中所述基因组序列选自差异甲基化区域、增强子、启动子以及CTCF结合位点。在一些实施方案中，所述效应子结构域包括Tet1或Dnmt3a。在一些方面，所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cas蛋白(例如dCas9蛋白)。在某些方面，所述方法还包括向所述个体施用抑制或增强DNA甲基化的试剂。所述试剂可以是小分子。举例来说，所述试剂是5-氮杂胞苷或5-氮杂脱氧胞苷。本文还公开了治疗有需要的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用编码包含与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰细胞中的一个或多个基因组序列的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：a.与具有甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及b.一个或多个指导序列，从而修饰所述细胞中的一个或多个基因组序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.19 US 62/377,5201.一种修饰细胞中的一个或多个基因组序列的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：a.与具有甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及b.一个或多个指导序列，从而修饰所述细胞中的一个或多个基因组序列。2.如权利要求1所述的方法，其中所述基因组序列包括差异甲基化区域、增强子、启动子或CTCF结合位点。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述基因组序列包括CTCF结合位点。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述效应子结构域包括Tet1。5.一种修饰细胞中的一个或多个基因组序列的方法，所述方法包括向所述细胞中引入：a.与具有脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及b.一个或多个指导序列，从而修饰所述细胞中的一个或多个基因组序列。6.如权利要求5所述的方法，其中所述基因组序列包括差异甲基化区域、增强子、启动子或CTCF结合位点。7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述基因组序列包括增强子或启动子。8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述基因组序列包括BDNF启动子。9.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述基因组序列包括MyoD的增强子。10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，其中所述效应子结构域包括Dnmt3a。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cas蛋白。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cas9蛋白。13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cpf1蛋白。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述指导序列是核糖核酸指导序列。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述指导序列具有约10个碱基对至约150个碱基对的长度。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个指导序列包括两个或更多个指导序列。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中在所述细胞中修饰2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个基因组序列。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞、神经元、有丝分裂后细胞或成纤维细胞。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述细胞是小鼠细胞。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括融合在所述无催化活性的位点特异性核酸酶与所述效应子结构域之间的一个或多个核定位序列。22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述基因组序列中的一个或多个与疾病或疾患有关。23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述细胞引入到非人类哺乳动物中。24.如权利要求22所述的方法，其中所述非人类哺乳动物是小鼠。25.一种分离的修饰的细胞，其是通过如前述权利要求中任一项所述的方法产生的。26.一种调节细胞中一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括向所述细胞中引入a.与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及b.指导序列或编码指导序列的核酸，从而调节细胞中所述一个或多个基因组序列的甲基化。27.如权利要求26所述的方法，其中所述基因组序列包括差异甲基化区域、增强子、启动子或CTCF结合位点。28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述基因组序列包括CTCF结合位点。29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述效应子结构域包括Tet1。30.如权利要求26或27所述的方法，其中所述基因组序列包括增强子或启动子。31.如权利要求26-27或30中任一项所述的方法，其中所述基因组序列包括BDNF启动子。32.如权利要求26-27或30中任一项所述的方法，其中所述基因组序列包括MyoD的增强子。33.如权利要求26-27或30-32中任一项所述的方法，其中所述效应子结构域包括Dnmt3a。34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cas蛋白。35.如权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cas9蛋白。36.如权利要求26-35中任一项所述的方法，其中所述无催化活性的位点特异性核酸酶是无催化活性的Cpf1蛋白。37.如权利要求26-36中任一项所述的方法，其中所述指导序列是核糖核酸指导序列。38.如权利要求26-37中任一项所述的方法，其中所述指导序列具有约10个碱基对至约150个碱基对的长度。39.如权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述一个或多个指导序列包括两个或更多个指导序列。40.如权利要求26-39中任一项所述的方法，其中在所述细胞中修饰2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个基因组序列。41.如权利要求26-40中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞、神经元、有丝分裂后细胞或成纤维细胞。42.如权利要求26-41中任一项所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。43.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述细胞是小鼠细胞。44.一种分离的修饰的细胞，其是通过如前述权利要求中任一项所述的方法产生的。45.一种治疗有需要的患者的方法，所述方法包括将根据权利要求44所述的修饰的细胞向需要所述细胞的患者施用。46.一种在有需要的个体中调节引起疾病的一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括向所述个体中引入a.与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶；以及b.一个或多个指导序列，从而在所述个体中调节所述引起疾病的一个或多个基因组序列的甲基化。47.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞具有修饰的基因组，所述修饰的基因组包含第一基因组修饰，其中基因组序列的甲基化已经被调节，其中所述调节通过使细胞与和具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域融合的无催化活性的位点特异性核酸酶和一个或多个指导序列接触而发生。48.一种调节细胞中一个或多个基因组序列的甲基化的方法，所述方法包括使所述细胞与以下接触：a.编码包含与具有甲基化活性或脱甲基化活性的效应子结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁道夫·耶尼施，X·肖恩·刘，吴昊，
申请(专利权)人：怀特黑德生物医学研究所，
类型：发明
国别省市：美国,US