一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段技术

本发明专利技术提供了一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段，DNA片段如式（I）所示：SEQ正向‑X‑SEQ反向（I），其中，SEQ正向是棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA片段中的至少包括21bp的任何一段；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向和SEQ反向均不互补，所述棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA如序列表中的序列1所示。本发明专利技术首次将棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为RNA干扰靶标基因，并应用于培育抗虫性提高的转基因植物中。虫试结果表明，转接后2天到5天棉铃虫幼虫的体重小于对照组体重的1/10；5天转基因烟草叶片上的幼虫死亡率达到68%，野生型烟草只有21%。

A Method for Improving Plant Insect Resistance by RNA Interference and Its Specific DNA Fragments

The present invention provides a method for improving plant insect resistance by RNA interference technology and a specific DNA fragment. The DNA fragment is shown in formula (I) as follows: SEQ forward X SEQ reverse (I). The SEQ forward is any segment of the full-length DNA fragment of chitin deacetylase 5A gene of Helicoverpa armigera, including at least 21 bp; SEQ reverse complements with SEQ forward and reverse; X is SEQ forward and SEQ reverse complementary; The full-length cDNA of the chitin deacetylase 5A gene of Helicoverpa armigera is shown in sequence 1 of the sequence table. For the first time, the chitin deacetylase 5A gene of Helicoverpa armigera is used as a target gene for RNA interference, and is applied to cultivate transgenic plants with improved insect resistance. The results of insect test showed that the weight of Helicoverpa armigera larvae was less than 1/10 of the control group from 2 to 5 days after transfer, the mortality rate of the larvae on the leaves of transgenic tobacco reached 68% and that of wild tobacco was only 21%.

【技术实现步骤摘要】
一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段。
技术介绍
真核细胞摄入dsRNA（双链RNA），会引起细胞内源同源mRNA的降解，从而造成对应基因表达受阻，这种现象被称之为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）。植物介导的RNAi技术是通过转基因技术，把表达昆虫基因的dsRNA（或者hpRNA，即发夹结构RNA）的基因表达盒导入到植物中，害虫取食这种含害虫基因dsRNA/hpRNA植物材料后，摄入的dsRNA/hpRNA会引起害虫的RNAi，有可能会起到抑制昆虫生长发育甚至杀死害虫的作用，从而达到保护植物的目的。2007年，MaoYB等在棉花中表达与棉酚解毒代谢直接相关P450基因（CYP6AE14）的dsRNA，饲喂棉铃虫后，CYP6AE14基因的表达水平显著降低，同时棉铃虫对棉酚的耐受性减弱，提高了棉酚对棉铃虫的毒性【非专利文献：MaoYB,CaiWJ,WangJW,etal.SilencingacottonbollwormP450monooxygenasegenebyplant-mediatedRNAiimpairslarvaltoleranceofgossypol.NatBiotechnol,2007,25(11):1307-1313.】。同年，Baum等先通过饲喂dsRNA试验从玉米根萤叶甲的290个候选靶标基因筛选出液泡ATP酶基因（vacuolarATPase,V-ATPase），然后将其转入玉米使转基因植株表达dsRNA，结果表明在防治玉米根萤叶甲有很好的效果【非专利文献：BaumJA,BogaertT,ClintonWetal.ControlofcoleopteraninsectpeststhroughRNAinterference.NatBiotechnol,2007,25:1322-1326.】。上述奠基性工作开创了植物抗虫基因工程研究领域的一个热点。植物介导的RNAi技术具有抗虫基因来源广、基因特异性强、残留低等优点。然而正是由于基因来源广泛，寻求合适的靶标基因成为该技术的关键点和难点。几丁质脱乙酰基酶（chitindeacetylase，CDA）参与昆虫几丁质的降解与修饰，催化几丁质转化为壳聚糖（其中的N-乙酰基葡糖胺的乙酰基的水解）。CDA的对昆虫生长发育的重要作用已经得到证实。2005年Guo等首次在粉纹夜蛾中肠cDNA文库中分离到CDA的cDNA序列，此基因编码的蛋白质能与几丁质相互结合，提出该蛋白的功能可能与围食膜的形成及更新有关。此后，在多种昆虫上进行了CDA编码基因的分子克隆及其表达分析研究。昆虫CDA分为五类（Group）。第1类和第2类含三个结构域：几丁质结合围食膜A结构域（ChitinbindingPeritrophin-Adomain，ChBD），低密度脂蛋白A类受体结构域（Low-densitylipoproteinreceptorclassAdomain，LDLa）和多糖脱乙酰基酶催化结构域（Polysaccharidedeacetylasecatalyticdomain，CDA）；第3类和第4类都没有LDLa结构域、有CDA与ChBD结构域，但二者结构域的位置存在较大差异；第5类CDA只具有CDA结构域。在此基础上，可将第1类进一步分成两个亚组（Ia、Ib），还发现在Ib亚组存在选择性剪接。五类CDA反映了昆虫CDA的进化关系，并且在不同物种昆虫生长发育中发挥着重要的作用。棉铃虫（Helicoverpaarmigera）是一种重要的农业害虫，危害棉花、玉米等多种农作物。上世纪90年代棉铃虫大爆发曾给我国棉花生产带来极大损失。转基因抗虫棉及其他措施的应用使得棉花生产得以平稳发展至今。将来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白δ-内毒素编码基因（Bt基因）通过转基因技术导入到农作物，使农作物能够表达杀虫蛋白以达到防治害虫的目的。除了Bt基因外，一种来自于豇豆的蛋白酶抑制剂（CpTI）基因也被用于我国的转基因抗虫棉品种。但是，当前转基因抗虫棉面临着抗虫性不理想、昆虫抗性进化、优良抗虫基因较单一等问题，亟待开发新的抗虫基因及方法。专利技术人在棉铃虫转录组数据发掘、基因克隆以及植物介导的RNAi研究中发现，棉铃虫的几丁质脱乙酰基酶5a基因可成为植物介导的RNAi的理想靶标基因，目前，还没有将棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为RNAi靶标基因来提高植物抗虫性的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种利用RNA干扰技术提高植物抗虫性的方法及其专用DNA片段，以解决现有转基因植物抗虫性不理想、昆虫抗性进化、优良抗虫基因较单一的问题。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一个如式（I）所示的DNA片段：SEQ正向-X-SEQ反向（I）其中，SEQ正向是棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA片段中的至少包括21bp的任何一段；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向和SEQ反向均不互补，且X的长度≥10bp；所述棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA如序列表中的序列1所示。进一步地，所述SEQ正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示。一种含有上述DNA片段的重组载体。所述重组载体通过如下方法构建：将序列表中序列2所示的DNA片段同时以正向和反向的方式插入到pRNAi-GG上，从而构成植物遗传转化载体。棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因作为RNA干扰靶标基因在提高植物抗虫性中的应用。一种提高植物抗虫性的方法，将上述的DNA片段导入目的植物中得到转基因植物，所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。进一步地，上述的DNA片段是通过所述的重组载体导入目的植物中的。进一步地，所述抗虫是指抗鳞翅目的昆虫。进一步地，所述抗虫是指抗鳞翅目昆虫的幼虫。更进一步地，所述抗虫是指抗棉铃虫的幼虫。进一步地，所述目的植物为可以被上述昆虫所取食的植物。更进一步，所述目的植物为陆地棉。本专利技术的方法具体包括以下步骤：1、获取基因序列通过设计合成引物，然后对棉铃虫mRNA进行反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR），或者通过化学合成，得到棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因序列（HaCDA5a基因，如序列表中序列1所示）。2、靶标序列的选取及棉铃虫5a型几丁质脱乙酰基酶特异dsRNA表达序列结构的设计（1）获得上述DNA序列后，选取其中的部分序列作为靶标序列，要求长度不短于21碱基对（bp），通过PCR技术扩增得到靶标序列；（2）利用DNA重组技术，将靶标序列构建成植物hpRNA（发卡RNA）表达结构，表达结构如式（I）所示：SEQ正向-X-SEQ反向（I）其中，所述SEQ正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示，SEQ反向和SEQ正向为序列相同、方向相反的序列，X序列为长度不短于10个核苷酸对（bp）且与SEQ正向和SEQ反向均不互补的任意DNA序列。3、载体构建及植物转化将含有上述表达结构的重组表达载体通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等成熟的植物遗传转化技术导入到目标植物中，从而提高目的植物对有关害虫的抗性。表达载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个如式（I）所示的DNA片段：SEQ正向‑X‑SEQ反向  （I）其中，SEQ正向是棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA片段中的至少包括21bp 的任何一段；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向和SEQ反向均不互补，且X的长度≥10bp；所述棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA如序列表中的序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一个如式（I）所示的DNA片段：SEQ正向-X-SEQ反向（I）其中，SEQ正向是棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA片段中的至少包括21bp的任何一段；SEQ反向与所述SEQ正向反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，X与所述SEQ正向和SEQ反向均不互补，且X的长度≥10bp；所述棉铃虫几丁质脱乙酰基酶5a基因的全长cDNA如序列表中的序列1所示。2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述SEQ正向的核苷酸序列如序列表中序列2所示。3.含有权利要求1或2所述DNA片段的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体通过如下方法构建：将序列表中序列2所示的DNA片段同时以正向和反向的方式插入到pRNAi...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继刚，史月芝，刘娟娟，张石凯，李洪宇，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北,13