提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法技术

本发明专利技术公开了分离的多核苷酸和多肽，重组DNA构建体、抑制DNA构建体和CRISPR/Cas9构建体，和使用抑制DNA构建体或CRISPR/Cas9构建体转化可再生植物细胞获得的组合物如植物或种子，所述植物或者种子中分离的多核苷酸的表达或活性发生变化。通过减少分离的多核苷酸的表达或活性获得耐旱性增加的植物。

Constructors and Methods for Improving Plant Abiotic Stress Tolerance

The present invention discloses separated polynucleotides and polypeptides, recombinant DNA constructs, inhibited DNA constructs and CRISPR/Cas9 constructs, and compositions obtained by transforming renewable plant cells with inhibited DNA constructs or CRISPR/Cas9 constructs, such as plants or seeds, where the expression or activity of separated polynucleotides in plants or seeds changes. Plants with increased drought tolerance were obtained by reducing the expression or activity of isolated polynucleotides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高植物非生物胁迫耐性的构建体和方法
本专利技术涉及植物育种和遗传学领域，特别是，涉及用于提高植物耐诸如干旱等非生物胁迫的构建体和方法。
技术介绍
生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。非生物胁迫是造成世界范围内农作物减产的主要原因，造成主要农作物平均减产50％以上(Boyer,J.S.(1982)Science218：443-448；Bray,E.A.等(2000)InBiochemistryandMolecularBiologyofPlants,editedbyBuchannan,B.B.等,Amer.Soc.PlantBiol.,pp.1158-1249)。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态形成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。干旱(有效水分不足)是一种主要的非生物胁迫，限制了世界范围内农作物的生产。在植物生长发育阶段，将植物暴露于水分限制环境下，将会激活植物各种不同生理和发育变化。近年来，尽管对非生物胁迫响应的分子机制和植物耐旱性的遗传调控网络进行了广泛的研究(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.(2006)Curr.Opin.PlantBiol.9：189-195；Wang，W.等(2003)Planta218：1-14；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等(2003)Curr.Opin.PlantBiol.6:410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)TrendsPlantSci.10:88-94；Farooq,M.等(2009)Agron.Sustain.Dev.29：185-212；和Hossain，M.A.，Wani，S.H.，Bhattacharjee，S.，Burritt，D.J.，Tran，L.-S.P.(2016)DroughtStressToleranceinPlants-Vol1edited)，但是植物如何感知、传导干旱胁迫信号和其耐旱性的生物化学和分子机制仍然是生物学研究中面临的一个主要挑战。分子标记辅助育种能够提高农作物的耐旱性。转基因途径提高农作物的耐旱性已经取得了很大进展(VinocurB.andAltmanA.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16:123-132；LawlorDW.(2013)J.Exp.Bot.64：83-108)。激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于拟南芥(Weigel，D.等(2000)PlantPhysiol.122：1003-1013)和水稻(Lu等(2014)PlantCellRep.33：617-631)的研究中。转录增强子原件的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于分离具有重要农艺性状表型的基因，包括提高非生物胁迫如耐旱性和耐冷性的基因。专利技术概述本专利技术包括以下具体实施例：在一个实施例中，本专利技术包括一个分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：2、5、8、11、14或17的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中减少所述多核苷酸的表达可增加植物的耐旱性。所述分离的多核苷酸包括SEQIDNO：2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17或18所示的核苷酸序列；所述分离的多核苷酸编码的多肽包括SEQIDNO：4、7、10、13、16或19所示的氨基酸序列。在另一个实施例中，本专利技术包括一个重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一个分离的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包括(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。在另一个实施例中，本专利技术包括一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：3、6、9、12、15或18的一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述抑制元件可抑制包括SEQIDNO：3(PRP1)、SEQIDNO：6(PP2C64)、SEQIDNO：9(OPPL1)、SEQIDNO：12(MFS9)、SEQIDNO：15(LAO1)或SEQIDNO：18(DN-DSP1)所示的多核苷酸区域的内源靶序列的表达。所述抑制元件包括(a)核苷酸序列为SEQIDNO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸序列；(b)编码的多肽的氨基酸序列为SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的多核苷酸序列；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。进一步的，抑制元件可包括SEQIDNO：45、46、47、48、49或50的多核苷酸。在另一个实施例中，本专利技术包括一个CRIPSR/Cas9构建体，所述CRIPSR/Cas9构建体包括一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源的调控元件和与其可操作连接的gRNA，其中，所述gRNA靶向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的靶基因组中区域，以降低内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。进一步的，所述gRNA靶向核苷酸序列为SEQIDNO：3、6、9、12、15、18、102、103、104、105、106或107的多核苷酸的基因组区域。在另一个实施例中，本专利技术包括一种植物，与对照植物中野生PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活力相比，所述植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活力降低；其中，与对照植物相比，所述植物表现出至少一种表型，所述表型选自：增强的耐旱性、增加的籽粒产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的多核苷酸，包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少85％的一致性；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少90％的序列一致性；或者(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中，减少所述多核苷酸的表达增加了植物的耐旱性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.19 CN 20161090905531.一种分离的多核苷酸，包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少85％的一致性；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：4、7、10、13、16或19相比，具有至少90％的序列一致性；或者(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中，减少所述多核苷酸的表达增加了植物的耐旱性。2.根据权利要求1分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括如下序列：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：17或SEQIDNO：18。3.根据权利要求1分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列包括如下序列：SEQIDNO：4、SEQIDNO：7、SEQIDNO：10、SEQIDNO：13、SEQIDNO：16或SEQIDNO：19。4.一个重组DNA构建体，其包括1-3任一权利要求中分离的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件。5.一种抑制DNA构建体体，其包含至少一个异源调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括1-3任一权利要求的多核苷酸的一个片段，所述抑制元件抑制内源靶基因的表达，所述内源靶基因序列包括：SEQIDNO：3(PRP1)、SEQIDNO：6(PP2C64)、SEQIDNO：9(OPPL1)、SEQIDNO：12(MFS9)、SEQIDNO：15(LAO1)或者SEQIDNO：18(DN-DSP1)表示的多核苷酸区域。6.根据权利要求5的抑制DNA构建体，所述抑制元件包括(a)核苷酸序列为SEQIDNO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码的氨基酸序列为SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的多肽的核苷酸序列；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。7.根据权利要求6的抑制DNA构建体，所述抑制元件包括SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：47、SEQIDNO：48、SEQIDNO：49或SEQIDNO：50。8.一种CRISPR/Cas构建体，其包含一个编码Cas9酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源调控元件和与其可操作连接的gRNA，所述gRNA靶向包括内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的靶基因组区域，并减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性。9.根据权利要求8的CRISPR/Cas构建体，所述gRNA靶向包含核苷酸序列为SEQIDNO:3、6、9、12、15、18、102、103、104、105、106或107的多核苷酸的基因组区域。10.一种植物，当与对照植物中野生型PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性相比，所述植物中内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或活性降低，其中所述植物与对照植物相比，表现出至少一种下述表型：增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐性、增加的生物量；所述植物通过下述步骤获得：(a)将抑制DNA构建体转入植物，所述抑制DNA构建体包含至少一个异源调控元件，和与其可操作连接的抑制元件，并减少序列为SEQIDNO：4、7、10、13、16或19，或与序列SEQIDNO：4、7、10、13、16或19一致性至少为95％的内源PRP1,PP2C64,OPPL1,MFS9,LAO1orDN-DSP1多肽的表达；或者(b)在包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因和其调控元件的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或者替换一个DNA片段，或者(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。11.根据权利要求10的植物，所述植物含有一个抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包括至少一个调控元件和与其可操作连接的抑制元件，所述抑制元件包括至少100bp下述序列：(a)一个多核苷酸，其核苷酸序列与SEQIDNO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为85％；(b)一个多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述植物与对照植物相比，显示出增加的耐旱性。12.根据权利要求11的植物，所述抑制元件包括至少100bp下述序列：(a)核苷酸序列为SEQIDNO：3、6、9、12、15或18的多核苷酸；(b)编码氨基酸序列为SEQIDNO：4、7、10、13、16或19的多肽的多核苷酸；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述植物与对照植物相比，显示出增加的耐旱性。13.根据权利要求12的植物，所述抑制元件包括核苷酸序列SEQIDNO：45、46、47、48、49或50，所述植物与对照植物相比，显示出增加的耐旱性。14.根据权利要求10的植物，所述植物含有突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因，其中与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达降低，或者所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的活性降低或者缺失，所述植物通过以下步骤获得：向包含内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段、或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变，以减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达或者活性。15.根据权利要求14的植物，所述植物通过向包含序列SEQIDNO：3、6、9、12、15或18或者与SEQIDNO：3、6、9、12、15或18一致性至少为90％的序列的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(i)引入一个或多个核苷酸的改变获得，所述改变减少内源OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1多肽的表达或者活性。16.根据权利要求15的植物，所述突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的核苷酸序列与SEQIDNO：3、6、9、12、15或18序列一致性至少为95％。17.根据权利要求15的植物，所述植物通过序列为SEQIDNO：90的gRNA对包含序列SEQIDNO：12或与SEQIDNO：12一致性至少为90％的序列的基因组区域(i)删除一个DNA片段或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变获得，所述改变减少内源OsMFS9多肽的表达或者活性。18.根据权利要求10的植物，所述植物含有突变的PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的调控元件,其中与对照植物相比，所述植物中PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因的表达降低，所述植物通过向内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1基因上游基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸的改变获得，所述改变减少内源PRP1、PP2C64、OPPL1、MFS9、LAO1或DN-DSP1多肽的表达。19.根据权利要求18的植物，所述植物通过向包含序列SEQIDNO：86、87、88、89、90、或91的基因组区域(i)引入一个DNA片段、删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，(ii)引入一个或多个核苷酸的改变而产生，所述改变减少内源OsPRP1、OsPP2C64、OsOPPL1、OsMFS9、OsLAO1或OsDN-DSP1多肽的表达。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光武，杜成凤，高阳，李赞堂，吕贵华，毛冠凡，王昌贵，王国奎，
申请(专利权)人：未名生物农业集团有限公司，先锋海外公司，
类型：发明
国别省市：北京,11