针对CTLA-4的单结构域抗体及其变体制造技术

本申请提供包含特异性识别CTLA‑4的单结构域抗体(sdAb)部分的构建体。也提供制备和使用这些构建体的方法。

Single Domain Antibody Against CTLA-4 and Its Variants

This application provides a construct containing a single domain antibody (sdAb) part specifically recognizing CTLA 4. Methods for preparing and using these constructs are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对CTLA-4的单结构域抗体及其变体相关申请本申请要求2016年10月11日提交的国际专利申请号PCT/CN2016/101777和2017年7月20日提交的国际专利申请号PCT/CN2017/093644的优先权权益，所述国际专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。采用ASCII文本文件进行的序列表提交采用ASCII文本文件进行的以下提交的内容以引用的方式整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：761422000341SEQLIST.txt，记录日期：2017年10月9日，大小：699KB)。专利
本专利技术涉及包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的构建体及其制备和使用方法。专利技术背景T细胞的活化不仅要求通过T细胞受体(TCR)进行刺激，而且也要求通过在T细胞表面上组成性表达的共刺激性表面分子诸如CD28进行额外信号传导。CD28的配体是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，其存在于抗原递呈细胞(APC)诸如树突细胞、活化的B细胞或单核细胞上。B7与CD28之间的相互作用是似乎足以触发抗原特异性T细胞的成熟和增殖的若干共刺激性信号传导路径中的一者。缺乏共刺激，由此伴随IL-2产生不充分，会阻止后续T细胞增殖以及诱导被称为“无反应性”的非反应性状态。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4或CD152)是CD28的同源物，并且被称为在活化的T细胞上得以上调的抑制性免疫检查点分子。CTLA-4也结合至B7-1和B7-2，但相比于CD28，具有更大亲和力。B7与CTLA-4之间的相互作用会减弱T细胞活化，此构成肿瘤免疫逃脱的重要机理。抗CTLA-4抗体疗法已在许多癌症诸如黑素瘤的情况下显示前景。单链抗体(sdAb)由于具有单一单体抗体可变结构域而不同于常规4链抗体。举例来说，骆驼科动物和鲨鱼产生被命名为仅有重链的抗体(HCAb)的单结构域抗体，其天然地缺乏轻链。骆驼科动物HCAb的各臂中的抗原结合片段具有单一重链可变结构域(VHH)，其可在不借助于轻链下展现对抗原的高亲和力。骆驼科动物VHH被称为最小功能性抗原结合片段，具有约15kD的分子量。本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容都据此以引用的方式整体并入本文。
技术实现思路
本专利技术涉及包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的构建体及其制备和使用方法。本申请的一个方面提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQIDNO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在根据任一上述经分离的抗CTLA-4构建体的一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQIDNO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在根据任一上述经分离的抗CTLA-4构建体的一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分包含以下中的任一者：(1)包含氨基酸序列SEQIDNO:17的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:49的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(2)包含氨基酸序列SEQIDNO:18的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:50的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:82的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(3)包含氨基酸序列SEQIDNO:19的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:51的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:83的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(4)包含氨基酸序列SEQIDNO:20的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:52的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:84的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(5)包含氨基酸序列SEQIDNO:21的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:53的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:85的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(6)包含氨基酸序列SEQIDNO:22的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:54的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:86的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(7)包含氨基酸序列SEQIDNO:23的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:55的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:87的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(8)包含氨基酸序列SEQIDNO:24的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:56的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:88的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(9)包含氨基酸序列SEQIDNO:25的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:57的CDR2或其包含多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含特异性识别CTLA‑4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA‑4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17‑32和213‑222中的任一者的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49‑64、233‑242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81‑96和253‑262中的任一者的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.11 CN PCT/CN2016/101777;2017.07.20 CN PCT/1.一种包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQIDNO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体。2.如权利要求1所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQIDNO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体。3.如权利要求1或2所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下中的任一者：(1)包含氨基酸序列SEQIDNO:17的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:49的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(2)包含氨基酸序列SEQIDNO:18的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:50的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:82的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(3)包含氨基酸序列SEQIDNO:19的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:51的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:83的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(4)包含氨基酸序列SEQIDNO:20的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:52的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:84的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(5)包含氨基酸序列SEQIDNO:21的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:53的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:85的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(6)包含氨基酸序列SEQIDNO:22的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:54的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:86的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(7)包含氨基酸序列SEQIDNO:23的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:55的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:87的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(8)包含氨基酸序列SEQIDNO:24的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:56的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:88的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(9)包含氨基酸序列SEQIDNO:25的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:57的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:89的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(10)包含氨基酸序列SEQIDNO:26的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:58的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:90的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(11)包含氨基酸序列SEQIDNO:27的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:59的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:91的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(12)包含氨基酸序列SEQIDNO:28的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:60的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:92的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(13)包含氨基酸序列SEQIDNO:29的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:61的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:93的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(14)包含氨基酸序列SEQIDNO:30的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:62的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:94的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(15)包含氨基酸序列SEQIDNO:31的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:63的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:95的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(16)包含氨基酸序列SEQIDNO:32的CDR1或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:64的CDR2或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:96的CDR3或其包含多达约3个氨基酸取代的变体；(17)包含氨基酸序列SEQIDNO:213的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:233的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:253的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(18)包含氨基酸序列SEQIDNO:214的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:234的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:254的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(19)包含氨基酸序列SEQIDNO:215的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:235的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:255的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(20)包含氨基酸序列SEQIDNO:216的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:236的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:256的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(21)包含氨基酸序列SEQIDNO:217的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:237的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:257的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(22)包含氨基酸序列SEQIDNO:218的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:238的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:258的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(23)包含氨基酸序列SEQIDNO:219的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:239的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:259的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(24)包含氨基酸序列SEQIDNO:220的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:240的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:260的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(25)包含氨基酸序列SEQIDNO:221的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:241的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:261的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；(26)包含氨基酸序列SEQIDNO:222的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:242的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:262的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；或(27)包含氨基酸序列SEQIDNO:214的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQIDNO:339的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQIDNO:254的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。4.如权利要求1-3中任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下中的任一者：(1)包含氨基酸序列SEQIDNO:17的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:49的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:81的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(2)包含氨基酸序列SEQIDNO:18的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:50的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:82的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(3)包含氨基酸序列SEQIDNO:19的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:51的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:83的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(4)包含氨基酸序列SEQIDNO:20的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:52的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:84的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(5)包含氨基酸序列SEQIDNO:21的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:53的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:85的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(6)包含氨基酸序列SEQIDNO:22的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:54的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:86的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(7)包含氨基酸序列SEQIDNO:23的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:55的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:87的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(8)包含氨基酸序列SEQIDNO:24的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:56的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:88的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(9)包含氨基酸序列SEQIDNO:25的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:57的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:89的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(10)包含氨基酸序列SEQIDNO:26的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:58的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:90的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(11)包含氨基酸序列SEQIDNO:27的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:59的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:91的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(12)包含氨基酸序列SEQIDNO:28的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:60的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:92的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(13)包含氨基酸序列SEQIDNO:29的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:61的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:93的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(14)包含氨基酸序列SEQIDNO:30的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:62的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:94的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(15)包含氨基酸序列SEQIDNO:31的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:63的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:95的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(16)包含氨基酸序列SEQIDNO:32的CDR1；包含氨基酸序列SEQIDNO:64的CDR2；和包含氨基酸序列SEQIDNO:96的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3个氨基酸取代的变体；(17)包含氨基酸序列S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚峰，武术，杨帅，周传初，
申请(专利权)人：南京传奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32