重组微囊藻毒素生产制造技术

本发明专利技术一般涉及用于生产微囊藻毒素的方法和能够产生微囊藻毒素的重组细胞。该重组细胞在外源启动子的控制下表达外源性微囊藻毒素合酶多肽，并进一步表达外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)。本发明专利技术进一步涉及通过本文所述方法在重组细胞中产生的微囊藻毒素。

Production of recombinant microcystins

The present invention generally relates to a method for producing microcystins and recombinant cells capable of producing microcystins. The recombinant cell expresses exogenous microcystin synthase polypeptide under the control of exogenous promoter, and further expresses exogenous phosphopantothenylthioethylaminotransferase (PPTase). The present invention further relates to microcystins produced in recombinant cells by the method described herein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组微囊藻毒素生产通过交叉引用并入本申请要求2016年10月17日提交的澳大利亚临时专利申请号2016904211的优先权，其全部内容通过交叉引用并入本文。
本专利技术总体涉及生产微囊藻毒素的方法和能够产生微囊藻毒素的重组细胞。本专利技术进一步涉及通过本文所述方法在重组细胞中产生的微囊藻毒素。
技术介绍
淡水体中蓝藻(“蓝绿藻”)毒素的产生对脊椎动物物种具有重要的健康意义。微囊藻毒素是蓝藻毒素中最大和结构最多样的。微囊藻毒素是由某些蓝藻物种的特定成员产生的肝毒素，这些蓝藻物种包括微囊藻、节球藻、长孢藻(以前的鱼腥藻)、颤藻、浮丝藻、软管藻、席藻和念珠藻。它们是具有七个氨基酸的单环七肽，在第1位含有D-丙氨酸(Ala)，在第2和第4位的每一个都含有可变L-氨基酸，在第3位含有D-β-甲基天冬氨酸(MeAsp)，在第5位含有(2S,3S,8S,9S)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸(Adda)，在第6位含有异D-谷氨酸(Glu)，以及在第7位含有N-甲基脱氢丙氨酸(MDha)。结构变异发生在所有七种氨基酸肽中，并且最常见于可变位置2和4(例如第2位的亮氨酸(L)、精氨酸(R)和酪氨酸(Y)，第4位的精氨酸(R)和丙氨酸(A))。不同形式的微囊藻毒素通常根据存在于这两个主要可变位置(即第2位和第4位)的L-氨基酸命名。例如，最大量和毒性形式的微囊藻毒素-LR在第2位具有亮氨酸(L)，在第4位具有精氨酸(R)。已经从不同种类的蓝藻中分离出100多种微囊藻毒素，因甲基化、羟基化、差向异构化、肽序列和/或毒性的程度不同而有所差异。负责在铜绿微囊藻PCC7806中产生微囊藻毒素的基因是成簇的，跨度为55kb。该途径由10个基因组成，转录为两个不同的操纵子，mcyC-mcyA和mcyD-mcyJ，编码一个聚酮合酶(PKS)、三个非核糖体肽合成酶(NRPS)和两个杂合PKS-NRPS。微囊藻毒素是全球最常见的淡水蓝藻毒素，引起急性中毒并长期诱发严重的肝损伤和肝癌。它们主要通过用于胆汁酸的多特异性主动转运系统进入肝脏。一旦进入细胞，它们共价结合到胞质蛋白上，导致它们驻留在肝脏中。除了对肝脏的不利影响外，微囊藻毒素还会影响心脏、胃肠道、神经系统和免疫系统，并且已显示出具有遗传毒性。它们也被认为是动物的潜在致癌物质，特别是通过抑制人体中的蛋白质磷酸酶导致细胞蛋白质的过度磷酸化。含有微囊藻毒素的大量出现在澳大利亚、巴西、中国、欧洲、美国和南非等国家都是一个问题。除了在人类消费的水生动物(即海产品)中的生物累积外，由于富营养化，微囊藻毒素已在饮用水源中广泛传播，这严重损害了饮用水质量。因此，微囊藻毒素的检测和毒理学研究的进展是必不可少的，但是由于微囊藻毒素的有限可用性和毒素标准的高成本而受到阻碍。需要可靠且经济上可行的系统来生产微囊藻毒素，作为从缓慢生长的蓝藻培养物中分离毒素的替代方案。还需要能够以直接的方式针对生产多种不同形式的微囊藻毒素而定制的系统。
技术实现思路
本专利技术人专利技术了一种用于在大肠杆菌中异源表达重组微囊藻毒素合成酶的系统。本文所述的表达平台可以定制为以靶向和经济有效的方式异源产生多种微囊藻毒素同种型及其变体。因此，本专利技术解决了现有技术中存在的一个或多个需求。下面列出了本专利技术的非限制性实施方案：实施方案1：用于产生微囊藻毒素的重组细胞，其包含：(i)一种或多种外源多核苷酸，其编码选自微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)、微囊藻毒素T多肽(mcyT)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的任意一种或多种微囊藻毒素多肽；(ii)与至少一种所述多核苷酸可操作地连接的外源启动子；(iii)外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。实施方案2：根据实施方案1的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；以及任选地微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素T多肽(mcyT)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的任意一种或多种。实施方案3：根据实施方案1的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；或者微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种。实施方案4：根据实施方案1至3中任一个的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyF基因序列和/或与GenBank登录号JQ290099.1、AJQ290089.1、F183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyI基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。实施方案5：根据实施方案1的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码：(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)和微囊藻毒素T多肽(mcyT)中的每一种；或(ii)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)和微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的每一种。实施方案6：根据实施方案1、2或5中任一个的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列和/或与GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生微囊藻毒素的重组细胞，包含：(i)编码选自以下的一种或多种微囊藻毒素多肽的一种或多种外源多核苷酸：微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素I多肽(mcyI)，微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，微囊藻毒素T多肽(mcyT)，微囊藻毒素L多肽(mcyL)；(ii)与至少一种所述多核苷酸可操作连接的外源启动子；以及(iii)外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.17 AU 20169042111.一种用于产生微囊藻毒素的重组细胞，包含：(i)编码选自以下的一种或多种微囊藻毒素多肽的一种或多种外源多核苷酸：微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素I多肽(mcyI)，微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，微囊藻毒素T多肽(mcyT)，微囊藻毒素L多肽(mcyL)；(ii)与至少一种所述多核苷酸可操作连接的外源启动子；以及(iii)外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。2.一种产生能够生产微囊藻毒素的重组细胞的方法，所述方法包括用以下物质转化亲本细胞：(i)编码选自以下的任何一种或多种微囊藻毒素多肽的一种或多种外源多核苷酸：微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素1多肽(mcyI)，微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，微囊藻毒素T多肽(mcyT)，微囊藻毒素L多肽(mcyL)；(ii)与至少一种所述mcy多核苷酸可操作连接的外源启动子；以及(iii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)的外源多核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的重组细胞或根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；以及可选地编码以下的任何一个或多个：微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素1多肽(mcyI)，微囊藻毒素T多肽(mcyT)，微囊藻毒素L多肽(mcyL)。4.根据权利要求1所述的重组细胞或根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素I多肽(mcyI)，微囊藻毒素J多肽(mcyJ)。5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的重组细胞，根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyF基因序列；和/或GenBank登录号JQ290099.1、AJQ290089.1、F183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyI基因序列。6.根据权利要求1所述的重组细胞或根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，和微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或者(ii)微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，和微囊藻毒素L多肽(mcyL)。7.根据权利要求1、3或6中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2、3或6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列；和/或GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列。8.根据权利要求1或3至7中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：GenBank登录号JQ290083.1、JQ290093.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyA基因序列；和/或GenBank登录号JQ290092.1、AY034602.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyB基因序列；和/或GenBank登录号JQ290083.1、JQ290091.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyC基因序列；和/或GenBank登录号JQ290094.1、JQ290084.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyD基因序列；和/或GenBank登录号JQ290095.1、JQ290085.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyE基因序列；和/或GenBank登录号JQ290097.1、JQ290087.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyG基因序列；和/或GenBank登录号JQ290098.1、JQ290088.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyH基因序列；和/或GenBank登录号JQ290100.1、JQ290090.1、AB254436.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：布雷特·尼兰，T·刘，R·玛兹莫兹，S·安格里，
申请(专利权)人：新南创新有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU