一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种敲除PD1的靶向的CD317嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：将靶向CD317的嵌合抗原受体CAR‑CD317的编码基因与载体相连，进行重组慢病毒的构建，并转染CD3阳性T淋巴细胞，将转染后的T细胞的PD1基因进行敲除，得到敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞。所述靶向CD317嵌合抗原受体T细胞敲除了PD1基因，有利于T细胞在患者体内的扩增，避免肿瘤细胞逃脱免疫监视，可以高效且特异性地杀伤CD317阳性肿瘤细胞，持久地维持活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。

A chimeric antigen receptor T cell targeting CD317 knockout of PD1 and its preparation and Application

The invention provides a preparation method of CD317 chimeric antigen receptor T cells targeting PD1. The preparation method includes: connecting the coding gene of the chimeric antigen receptor CAR CD317 targeting CD317 with the vector, constructing recombinant lentivirus, transfecting CD3 positive T lymphocytes, knocking out the PD1 gene of the transfected T cells, and obtaining the chimeric antigen receptor T cells targeting CD317 targeting PD1. Cells. The target CD317 chimeric antigen receptor T cells knock out the PD1 gene, which is beneficial to the expansion of T cells in patients, avoids the immune surveillance of tumor cells, kills CD317-positive tumor cells efficiently and specifically, maintains vitality and lethality for a long time, and does not cause damage to normal cells.

【技术实现步骤摘要】
一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学生物领域，特别涉及一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
恶性肿瘤(癌症)已成为威胁人类生命的元凶，发病率成上升趋势。CD317是脂筏相关蛋白，主要表达在肝癌、结肠癌等多种实体瘤细胞上，而在普通细胞中几乎很少表达。CD317的表达往往是细胞对gamma-干扰素通路的应答表现，因此与肿瘤的发生有密切关系。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。但目前CAR-T技术的应用还局限于血液瘤，对肝癌等多种实体瘤还未有进展。程序性死亡蛋白(PD1)是免疫检查点抑制(immunecheckpointinhibition)中的代表性分子，在机体免疫中通过阻止T细胞激活来负向调节免疫反应，以防止自身免疫疾病并保证自体耐受。在肿瘤微环境中，PD1会抑制杀伤性T细胞的活性，从而使肿瘤细胞逃脱免疫监视。目前还未有敲除PD1的靶向CD317的嵌合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受体CAR‑CD317的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD317的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因包括编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)将所述CAR‑CD317的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD‑CAR‑CD317重组质粒；(3)包装所述pWPXLD‑CAR‑CD317重组质粒，得到重组慢病毒；(4)将所述...

【技术特征摘要】
1.一种敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：(1)提供靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向CD317的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向CD317的单链抗体的编码基因包括编码如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)将所述CAR-CD317的编码基因插入到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-CD317重组质粒；(3)包装所述pWPXLD-CAR-CD317重组质粒，得到重组慢病毒；(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得嵌合抗原受体T细胞；(5)敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，获得敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞。2.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述胞内信号区包括4-1BB信号区和CD3ζ信号区。3.如权利要求1或2所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向CD317的嵌合抗原受体CAR-CD317的编码基因包括如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的敲除PD1的靶向CD317的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述敲除所述嵌合抗原受体T细胞的PD1基因，包括：将所述Cas9的编码基因插入至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-cas9重组质粒，以所述pcDNA3.1-cas9重组质粒为模板进行体外转录得到Cas9mRNA；提供靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列；将所述靶向PD1基因的sgRNA对应的基因序列插入至pcDNA3.1载体中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重组质粒，以所述pcDNA3.1-PD1-s...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏玲，龙丽梅，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44