一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法。本发明专利技术所述方法将梅毒螺旋体接种兔子繁殖培养，然后在小鼠皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，获得梅毒螺旋体小鼠模型。本发明专利技术针对现有小鼠对梅毒螺旋体感染的反应性很小，缺少梅毒螺旋体小鼠模型的问题，采用特定品系小鼠同时在皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，构建出梅毒螺旋体小鼠模型，所述小鼠模型能够在血液，肝脏，脾脏和睾丸检测到梅毒螺旋体并且可实现梅毒螺旋体的血液和淋巴结播散，且能够反映出梅毒螺旋体DNA疫苗的抑制作用，符合作为梅毒螺旋体动物模型的要求。

A Method for Establishing Treponema pallidum Mice Model

The invention relates to the field of biotechnology, and discloses a method for constructing a mouse model of Treponema pallidum. The method of the invention inoculates Treponema pallidum into rabbits for reproductive culture, and then inoculates Treponema pallidum into mice intradermis, peritoneum, rectum and penile cavernosum to obtain a Treponema pallidum mouse model. The present invention aims at the problem that the existing mice have little reactivity to Treponema pallidum infection and lack of Treponema pallidum mouse models. A Treponema pallidum mouse model is constructed by inoculating specific strains of mice with Treponema pallidum simultaneously in the skin, peritoneum, rectum and penis cavernosum. The mouse model can detect Treponema pallidum in blood, liver, spleen and testis. It can also disseminate blood and lymph nodes of Treponema pallidum, and reflect the inhibitory effect of Treponema pallidum DNA vaccine, which meets the requirements of animal model of Treponema pallidum.

【技术实现步骤摘要】
一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法。
技术介绍
梅毒是由梅毒螺旋体引起的慢性性传播疾病。目前，其仍然是一种全球流行的疾病，估计全世界有3600万例病例。近年来，男男同性恋者的梅毒发病率急剧上升。先天性梅毒感染的发病率也在上升，全世界每年估计有136万孕妇感染，其中约520,000例导致流产或死产等。此外，梅毒还增加了感染HIV的风险。尽管梅毒螺旋体对青霉素治疗依然敏感，但全球梅毒患病率却依然增加，因此迫切需要开发有效的梅毒疫苗作为全球消除梅毒的传统筛查和治疗方法的补充。梅毒疫苗的开发研究需要梅毒螺旋体动物模型评估候选疫苗抑制梅毒螺旋体感染的免疫原性和保护效应。由于小鼠对梅毒螺旋体感染的反应性很小，因此在梅毒研究中尚未被广泛使用。目前梅毒研究的主要动物模型是兔子，但是近交体系的兔子是昂贵的并且不容易获得。已有的研究成果中的候选疫苗可以抑制梅毒螺旋体向远端器官的传播，但是缺乏研究兔体液免疫和细胞免疫的试剂，这种保护机制的研究很难进入下一步。因此，急需构建一种动物模型，且这种动物模型所需的免疫保护性试剂容易获得并且免疫系统的遗传操作是常用的，进而帮助研究者进一步研究梅毒螺旋体鞭毛蛋白抑制其宿主体内扩散的免疫原性和保护性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法，使得所述方法能够成功构建梅毒螺旋体感染的小鼠模型，并可用于相关疫苗抑制梅毒螺旋体感染的免疫原性和保护效应的评估研究中。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法，梅毒螺旋体接种兔子繁殖培养，然后在小鼠皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，获得梅毒螺旋体小鼠模型。作为优选，所述梅毒螺旋体接种兔子繁殖培养为梅毒螺旋体通过睾丸内接种成年新西兰白兔来繁殖培养。在本专利技术具体实施方式中，所述小鼠皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体的个数为2.5×106个梅毒螺旋体(共1×107个)。其中，所述小鼠皮内为肩胛骨之间的皮内，所述直肠内接种采用灌胃方式接种。在本专利技术具体实施方式中，所述小鼠为C57BL/6小鼠。采用本专利技术方法将C57BL/6小鼠梅毒感染30天后，在血液，肝脏，脾脏、脑组织和睾丸检测到梅毒螺旋体。同时，采用具有抑制梅毒螺旋体的DNA疫苗免疫的小鼠，各组织中的梅毒螺旋体的载量有明显下降。而且，用梅毒螺旋体感染成功的小鼠淋巴结转染到正常新西兰兔的睾丸中，发现了活的梅毒螺旋体。根据上述试验结果，本专利技术认为和人体宿主一样，C57BL/6小鼠模型也能出现梅毒螺旋体的血管播散，符合作为梅毒螺旋体血液和淋巴结扩散动物模型的要求，且能够反映出疫苗的抑制作用。因此，本专利技术提出了所述方法构建的梅毒螺旋体小鼠模型在评估梅毒螺旋体疫苗免疫原性和/或保护效应中的应用。其中，所述梅毒螺旋体疫苗优选为梅毒螺旋体DNA疫苗。由以上技术方案可知，本专利技术针对现有小鼠对梅毒螺旋体感染的反应性很小，缺少梅毒螺旋体小鼠模型的问题，采用特定品系小鼠同时在皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，构建出梅毒螺旋体小鼠模型，所述小鼠模型能够在血液，肝脏，脾脏和睾丸检测到梅毒螺旋体并且可实现梅毒螺旋体的血液和淋巴结播散，且能够反映出疫苗的抑制作用，符合作为梅毒螺旋体动物模型的要求。附图说明图1所示为小鼠各组织中梅毒螺旋体DNA的RT-qPCR检测结果；其中，A-F依次为小鼠血液、肝脏、脾脏、淋巴结、大脑、睾丸的结果；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，NS表示无显著差异；图2所示为小鼠睾丸、肝脏和脾脏组织的免疫组化结果；其中，A为睾丸，B为肝脏，C为脾脏。具体实施方式本专利技术公开了一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下就本专利技术所提供的一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法做进一步说明。实施例1：构建梅毒螺旋体小鼠模型以及血液扩散验证梅毒螺旋体通过睾丸内接种成年新西兰白兔来繁殖培养，小鼠皮内(在肩胛骨之间)，腹膜内，直肠内(灌胃)和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，每个部位2.5×106个梅毒螺旋体(共1×107个)。直肠接种采用灌胃的方式，其他部位采用注射接种。每隔一天评估小鼠皮肤或全身感染的迹象。在接种后第30天处死小鼠。收集睾丸，淋巴结(腹股沟/肱/腋窝)，脾，肝，血和脑组织用于RT-qPCR检测分析。小鼠免疫：将小鼠随机分配，每组9只。通过肌肉注射进行小鼠免疫，pcDNA/CpG-FlaB3与pcDNA3/FlaB3均具有抑制梅毒螺旋体的作用。第一组用pcDNA/CpG-FlaB3(100μg)免疫；第二组用pcDNA3/FlaB3(200μg)免疫；作为空白对照，给小鼠单独注射pcDNA3载体。结果如图1所示，本专利技术采用RT-PCR检测梅毒螺旋体菌在血液、淋巴结、睾丸、大脑、肝脏和脾脏中的载量，对照组各组织显示出更高的梅毒螺旋体的载量，而免疫两种DNA疫苗的处理组，各组织中的载量明显减少，其中pcDNA3/CpG-FlaB3抑制效果更高。实施例2：梅毒螺旋体小鼠模型免疫组化验证小鼠模型构建和免疫同实施例1在感染后30天从每只小鼠的睾丸、肝脏和脾脏取活检穿孔样品(2mm)并送至华南大学。将组织在福尔马林中固定并用苏木精和曙红染色或用抗-T进行免疫组织化学染色(图2)。图2结果显示，在对照组的睾丸、肝脏和脾脏中发现了大量梅毒螺旋体，而在免疫pcDNA3/FlaB3以及pcDNA3/CpG-FlaB3的感染小鼠的睾丸、肝脏和脾脏中，螺旋体的载量明显减少。实施例3：梅毒螺旋体小鼠模型淋巴结扩散验证1)Tp感染30天后，无菌分离C57BL/6小鼠(3只/组)腹股沟、臂丛和腋窝淋巴结置于无菌培养皿中，加入1mL生理盐水；2)用医用注射器(5mL)柔软部分充分研磨淋巴结，将培养皿置于平台旋转器上10min，移除淋巴结碎片，分别吸取2mL菌液；3)将每组小鼠收集的Tp菌液分别感染3只新西兰兔，睾丸用碘伏消毒后注射1mL菌液；4)每天观察新西兰兔睾丸炎症情况，每隔一周进行血清学检测(RPR和TPPA)；5)感染9w后，麻醉处死新西兰兔，无菌分离睾丸，暗视野显微镜和qRT-PCR计数睾丸组织中Tp载量。结果见表1表1新西兰兔淋巴结转染实验的血清学反应a‘+’代表新西兰兔血清学TPPA和RPR反应阳性；b新西兰兔睾丸内梅毒螺旋体载量。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法，其特征在于，梅毒螺旋体接种兔子繁殖培养，然后在小鼠皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，获得梅毒螺旋体小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.一种构建梅毒螺旋体小鼠模型的方法，其特征在于，梅毒螺旋体接种兔子繁殖培养，然后在小鼠皮内、腹膜内、直肠内和阴茎海绵体接种梅毒螺旋体，获得梅毒螺旋体小鼠模型。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述梅毒螺旋体接种兔子繁殖培养为梅毒螺旋体通过睾丸内接种成年新西兰白兔来繁殖培养。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述小鼠皮内为肩胛骨之间的皮内。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述小鼠皮内、腹膜内...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴移谋，郑康，徐嫚，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43