一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结果表明，本发明专利技术能从转基因猪血浆中分离纯化出高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清白蛋白用于临床用药和生化研究中。

Separation and Purification of Recombinant Human Serum Albumin

The invention discloses a method for separating and purifying recombinant human serum albumin. In this method, the recombinant human albumin was purified from the transgenic pig plasma by hot ethanol precipitation. Then, two chromatography methods were used for further purification. The first step was refined by anion exchange chromatography, and then purified by reverse phase chromatography or gel chromatography for two times. The results show that the recombinant human serum albumin can be purified from transgenic pig plasma and is expected to replace human serum albumin for clinical medication and biochemical research.

【技术实现步骤摘要】
一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法
本专利技术属于生物领域，涉及一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法。
技术介绍
人血清白蛋白(HSA)具有重要的应用价值，不仅在临床上用于治疗出血性休克、烧伤、肝硬化或者肾病引起的腹水等疾病；还应用于药剂辅料、诊断试剂、手性物质分离剂、培养基添加剂等的研究。目前，仅从人血液中提取HSA难以满足市场的需求，且人血来源极其复杂，存在血源污染等潜在威胁。因此，迫切需要一种安全可靠、成本相对低廉的HSA替代品。随着基因重组技术飞速发展，通过基因工程获得重组人血清白蛋白(rHSA)并进一步通过纯化获取rHSA可能是一条有效的解决途径。常用白蛋白提取方法可以分为较传统的蛋白沉淀法和新技术发展而来层析色谱法。沉淀法是通过沉淀的方式来实现目标蛋白与杂质的分离。一般为了使蛋白质发生沉淀，可以通过降低静电力或蛋白质水溶液的稳定性来达到，其中降低蛋白质水溶液的稳定性是通过破坏蛋白质分子周围的水化层来实现。常用的白蛋白的沉淀方法有：低温乙醇沉淀法、盐析法、利凡诺沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、热乙醇沉淀法等。液相色谱法是通过待分离物与固定相之间的物理化学性质以及生物学性质的相互作用的不同来进行分离纯化目标产物。随着材料新技术的发展，液相色谱技术的分离性能更高，适用范围更广，已成为蛋白分离纯化的常用方法。目前液相色谱法主要有凝胶色谱、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱和反相色谱等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的方法。本专利技术提供的对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液；2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液；3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。上述方法中，所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得；具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L；所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液；具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃；所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃；所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。具体的，所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L；具体为6g/L；所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；具体为8g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同；所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％；具体为10％；所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h；所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水；所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/LTris-HCl(pH值为8.8)，流动相B为0.02mol/LTris-HCl(pH值为8.8)+0.3mol/LNaCl；所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检测波长为280nm；梯度洗脱程序为：0～第5min末，100％A；第6min起～第50min末，100％A～0％A；第51min起～第60min末，0％A。所述步骤3)中，所述反相色谱柱为C4-C18反相色谱柱；所述凝胶色谱柱为SEC柱。所述步骤3)用反相色谱柱进行二次精纯化步骤中，流动相A为由乙腈和三氟乙酸及水组成的混合液，其中，乙腈的体积百分浓度为2％，三氟乙酸的体积百分浓度为0.1％；流动相B为98％乙腈-0.1％三氟乙酸溶液(也即由乙腈和三氟乙酸及水组成的混合液，其中，乙腈的体积百分浓度为98％，三氟乙酸的体积百分浓度为0.1％)；流速为0.7mL/min；柱温为35℃；检测波长为280nm；梯度洗脱程序为：0～第10min末，100％A；第11min起～45min末，100％A～5％A；第46min起～第50min末，5％A；第51min起～第53min末，5％A～100％A；第54min起～第60min末，100％A。所述步骤3)用凝胶色谱柱进行二次精纯化步骤中，流动相为pH7.0的0.15mol/L磷酸盐缓冲液；流速为0.35mL/min；柱温为25℃；检测波长为214nm。上述步骤2)和3)中，脱盐浓缩为各种常规方法，如具体可为利用规格为30kD超滤管离心管脱盐浓缩，离心力为4500-5500×g，时间为50-70min；离心次数为2-4次；具体为2次。上述方法中，所用含有重组人血清白蛋白的血浆可按照如下方法获得：利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行编辑，在猪白蛋白基因区域插入人血清白蛋白基因，使猪血中只产生rHSA，通过纯化猪血浆即可获得大量高纯度的rHSA；或者参照如下文献方法获得：ProductionofHumanAlbumininPigsThroughCRISPR/Cas9-MediatedKnockinofHumancDNAintoSwineAlbuminLocusintheZygotes，JinPeng1,*,YongWang2,*,SCIENTIFICREPORTS，5:16705，DOI:10.1038/srep16705。本专利技术的优点：1、本专利技术采用热乙醇沉淀法进行rHSA粗提取，这是一种低温乙醇沉淀法的改进方法，相较于低温乙醇沉淀法较多提取步骤、更严格的低温生产环境和长达一周的生产周期，本专利技术的方法操作简便、耗时更短，纯化成本较低。2、本专利技术采用热乙醇沉淀法与液相色谱法相结合进行rHSA的纯化，既利用了热乙醇沉淀法操作简便和适用大量血浆粗提取的优点，又可利用色谱方法的高分离性能的优点进行精纯化，得到更高纯度的rHSA产品。3、本专利技术阴离子交换色谱后，又采用反相色谱或凝胶色谱对粗提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液；2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液；3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。

【技术特征摘要】
1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液；2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液；3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得；具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L；所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液；具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃；所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃；所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱小红，张养军，余谦，张普民，高方圆，焦丰龙，夏朝双，张汉卿，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11