肺癌中的T细胞亚群及其特征基因制造技术

本发明专利技术利用单细胞转录组分析技术，通过分析肺癌组织中浸润的T细胞的单细胞基因表达谱，分离和表征了能反映肺癌患者机体肿瘤免疫状态的T细胞亚群，即，表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的耗竭性CD8

T cell subsets and their characteristic genes in lung cancer

By using single cell transcriptome analysis technology, the single cell gene expression profiles of infiltrating T cells in lung cancer tissues are analyzed, and T cell subsets that can reflect the immune status of lung cancer patients are separated and characterized, i.e., exhaustive CD8 expressing genes TNFRSF9, TNFRSF18 and LAYN.

【技术实现步骤摘要】
肺癌中的T细胞亚群及其特征基因
本专利技术涉及生物
，尤其是总体上涉及细胞或细胞亚群，特别是源自肺癌组织的T细胞亚群的鉴定、表征以及富集。本专利技术也涉及分离肺癌中T细胞亚群的一系列标记、分离方法和所得到的制剂，以及使用分离肺癌中的T细胞亚群用于药物研究与开发和用于诊断、治疗和其他临床与非临床应用。
技术介绍
一般认为，T淋巴细胞参与的适应性免疫应答是人体对抗肿瘤细胞主要途径之一。当前免疫治疗已经成为肿瘤临床治疗中不可或缺的环节。免疫治疗的药物和方案涉及到机体免疫系统识别和攻击癌细胞的各个阶段。已有的肿瘤免疫的药物包括以下多个类型：靶向癌细胞的抗体、过继细胞治疗、溶瘤病毒、树突状细胞相关治疗、DNA和蛋白水平的肿瘤疫苗、免疫激活细胞因子以及其他免疫调节化合物。这些药物涉及机体免疫系统识别和杀伤肿瘤的各个阶段。其中针对T细胞检验点抑制蛋白的抗体类药物和肿瘤抗原特异性的T细胞过继疗法近年来取得突破，广受瞩目。针对T细胞检验点抑制剂是一种抗体类免疫治疗，通过恢复细胞毒T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)的活性来监控和杀死肿瘤细胞。肿瘤微环境中的效应T细胞受到抑制而无法杀死肿瘤细胞，这是由于肿瘤中存在多种免疫逃逸机制。人们针对已知的免疫逃逸机制设计出加强或阻碍相关通路的抗体，从而增强免疫系统的作用。例如靶向CTLA-4的药物Ipilimumab，通过阻断CTLA-4来解除调节性T细胞(Tregular，Treg)对CTL的抑制作用。PD-1是T细胞表面表达的PD-L1/L2的受体，后者在肿瘤细胞表面表达，两者结合后会激活T细胞的凋亡通路。抗体类药物Nivolumab通过阻断T细胞表面的PD-1来抑制其与PD-L1/L2的结合，从而抑制T细胞失活或凋亡，使CTL始终具有免疫活性。反过来，靶向PD-L1的MDX-1151也可以有效的提高肺癌、黑色素瘤和肾癌的生存率。但是，与靶向治疗等类似，T细胞检验点抑制剂的靶点仍有进一步拓展的空间；同时，如何寻找到更多的有效应答的患者，也需要从生物学上系统的了解T细胞在癌组织中的反应过程。另一方面，肿瘤的早期诊断、早期治疗和预后的判断，对提高肿瘤的治疗效果、患者的生存率有重要意义。利用分子生物学技术确定可靠的肿瘤标志物，对预测肿瘤临床结局，靶向治疗和评价疗效均有重要意义。目前发现的肿瘤预后标志物主要包括抑癌基因、癌基因、细胞周期调控因子、凋亡调控因子、侵袭和转移相关标志物、端粒酶等。能够用于监测和评估肿瘤免疫状态的分子标志物还很少。理解免疫系统与癌组织的相互作用成为开发和改善免疫疗法的关键，也能对机体的肿瘤免疫状态提供评估和监测的手段。但是浸润到癌组织中T细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)的类别、分化以及受抑制的途径迄今还没有被完整理解。目前已知TIL中存在耗竭T细胞、失能的T细胞或老化的T细胞群体。考虑到人体免疫细胞、特别是T细胞类型的复杂性，需要从更高精度认识与肿瘤相关的免疫细胞的分类、分化过程和功能基因，进一步为肿瘤免疫治疗药物开发提供更多潜在的免疫靶点，以及可用于肿瘤预后的分子标志物。近年来，迅速发展的单细胞测序技术为群体细胞以及单细胞的基因表达差异研究提供了有力的支撑。目前已发展出STRT-Seq(single-celltaggedreversetranscriptionsequencing)、Smart-Seq和Smart-Seq2、Cell-Seq(cellexpressionbylinearamplificationandsequencing)和PMA-Seq(Phi29-mRNAamplificationandsequencing)等单细胞转录组深度测序方法，以及多种与之匹配的生物信息学分析方法。
技术实现思路
本专利技术专利技术人利用单细胞转录组分析技术，通过分析肺癌组织中浸润的T细胞的单细胞基因表达谱，分离和表征了能反映肺癌患者机体肿瘤免疫状态的T细胞亚群，并进一步研究确定了该细胞亚群所表达的特征基因，以及这些特征基因与肿瘤预后之间的关系，在此基础上完成了本专利技术。本专利技术对肺癌患者外周血中T细胞、肿瘤周围正常组织中T细胞和肿瘤内浸润的T细胞，依据T细胞的表面分子CD4、CD8、CD25的表达筛选出辅助性T细胞(CD4+CD25-)、细胞毒T细胞(CD8+)和调节性T细胞(CD4+CD25+)，获取每类细胞的单细胞基因表达谱，并通过单细胞基因表达量的SC3非监督聚类获得了6个不同的CD8+T细胞亚群，9个不同的CD4+T细胞亚群，依据各亚群中细胞特征性基因的表达判定出肿瘤中的耗竭T细胞和非耗竭性T细胞，对比这两类细胞的基因表达谱，以表达量绝对值差异(FoldChange)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01为标准，将其中耗竭性T细胞相对于非耗竭T细胞差异高表达的基因定义为T细胞耗竭相关基因，获得了55个T细胞耗竭相关基因(见表1)。同样，判定出肿瘤中的有活性的调节性T细胞与其他调节性T细胞，对比这两类细胞的基因表达谱，以表达量绝对值差异(FoldChange)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01为标准，将其中有活性的调节性T细胞相对于其他调节性T细胞差异高表达的基因定义为调节性T细胞抑制功能相关基因，获得了21个调节性T细胞抑制功能相关基因(见表2)。对上述55个T细胞耗竭相关基因和21个调节性T细胞抑制功能相关基因，利用TCGA的LUAD数据集，依据数据集中每个病人的相应基因表达量，进行标准化转化后，计算出单个病人的55个T细胞耗竭相关基因集合的平均表达水平，以及21个调节性T细胞抑制功能相关基因集合的平均表达水平。以所有病人的55个基因平均表达水平值的中位值作为阈值，将病人分为T细胞耗竭相关基因高表达组和低表达组，比较两组病人生存时间的差异，发现高表达组的生存时间短于低表达组，差异具有显著性，表明所述的55个基因集合具有肺癌预后判断的效能。同样，以所有病人的21个基因平均表达水平值的中位值作为阈值，将病人分为调节性T细胞抑制功能相关基因高表达组和低表达组，比较两组病人生存时间的差异，发现高表达组的生存时间短于低表达组，差异具有显著性，表明所述的21个基因集合也具有肺癌预后判断的效能。采用同样的研发方法研究发现，所述55个T细胞耗竭相关基因和21个调节性T细胞抑制功能相关基因中包含3个相同的基因：TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，所述TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的组合也具有肺癌预后的判断效能。而以单独的基因为区分指标时，单独的IL1R2基因具有很好的肺癌预后判断效能。因此，本专利技术在广义上是针对可以用来鉴定或表征并且任选地用来分离、划分、分开或富集与肺癌的肿瘤免疫有关的T细胞亚群的一系列标记、方法、化合物、组合物和制造品。所述的T细胞包括CD8+T细胞和CD4+T细胞，尤其是耗竭性CD8+T细胞和有活性的调节性CD4+T细胞。更具体地，本申请的专利技术人已经发现一系列可以独立或共同地用来精确鉴定、分选、富集和/或表征来自肺癌的T细胞亚群的标记。使用选择的生物化学技术，通过本专利技术的标记与肺癌的肿瘤组织中的T细胞关联，能够富集、分离或纯化出反映肺癌的肿瘤免疫状态的T细胞亚群。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的CD4

【技术特征摘要】
1.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的CD4+T细胞的生物标志物组，其包含基因IL1R2，或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段；优选，所述生物标志物组为基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段。2.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞的生物标志物组，其包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段；优选，所述T细胞是CD8+T细胞；优选，所述T细胞是CD4+T细胞；优选，所述T细胞是CD8+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种，或者所述至少一种基因所编码的蛋白或蛋白片段；更优选，所述T细胞是CD8+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段；优选，所述T细胞是CD4+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种，或者所述至少一种基因所编码的蛋白或蛋白片段；更优选，所述T细胞是CD4+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。3.基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段在制备肺癌患者预后判断的试剂中的应用。4.一组生物标志物组在制备肺癌患者预后判断的试剂中的应用，所述生物标志物组包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段；优选，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段；优选，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。5.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂，所述试剂包含能与基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。6.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂，所述试剂包含能与基因TNFRSF9或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因TNFRSF18或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，以及，能与基因LAYN或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂；优选，所述检测试剂进一步包含一个或多个结合剂，所述每个结合剂能与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为T细胞耗竭相关基因或调节性T细胞抑制功能相关基因；优选，所述T细胞耗竭相关基因选自CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX...

【专利技术属性】
技术研发人员：张泽民，张园园，郭心怡，郑良涛，郑春红，胡学达，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11