本发明专利技术提供了用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组，所述引物组包含两对引物，所述第一对引物的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，所述第二对引物序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。本发明专利技术可同时对染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒进行快速检测，而且可以简化操作程序、节约成本。
Primers and kits for detection of infectious spleen and kidney necrosis virus and mandarin fish rhabdovirus
The present invention provides a primer group for detecting infectious spleen and kidney necrosis virus and mandarin fish rhabdovirus. The primer group comprises two pairs of primers, the first pair of primers is SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, and the second pair of primers is SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8. The invention can simultaneously detect dyeing spleen and kidney necrosis virus and mandarin fish rhabdovirus, and can simplify operation procedure and save cost.
【技术实现步骤摘要】
用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒
本专利技术属于水产病害微生物检测
，具体涉及用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒。
技术介绍
传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)和鳜鱼弹状病毒(Sinipercachuatsirhabdovirus,SCRV)是近年来影响鳜鱼养殖业的主要病毒性病原，该两种病毒所引起的鱼病有高发病率，高传染性和高致死率的后果，给养殖业带来巨大的经济损失。传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)属于虹彩病毒科肿大细胞属，为双链DNA病毒。ISKNV主要在石斑鱼和鳜鱼等海淡水养殖鱼类中流行，其中对鳜鱼致死率可高达100％。鳜弹状病毒(SCRV)由张奇亚等通过电镜观察在患病鳜鱼组织中发现，该病表现为内脏器官和表皮出血的临床症状，致死率可达到90-100％。目前，对于传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的诊断方法有很多种，包括病毒分离、电镜观察、核酸带型分析等，但都存在耗时长、操作复杂等弊端，不利于ISKNV和SCRV的调查研究。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)能将微量的DNA在短时间内大幅增加，具有特异性强、灵敏度高、快速简单的特点。ISKNV和SCRV的PCR检测方法已经较广泛建立起来，但是一般的PCR反应一次只能检测一种对应的致病病毒，而鱼类通常会出现两种病毒混合感染的现象而需要通过多次检测和测序才能确定毒株类型，使得检测时间延长，费用增加，延误鳜鱼ISKNV和SCRV的防治。因此建立ISKNV和SCRV双重PCR，同时检测出ISKNV和SCRV，能缩短检测时间，降低成本，对鳜鱼ISKNV和SCRV的防治具有重要意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包含两对引物，所述第一对引物的序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4，所述第二对引物序列如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示。本专利技术还提供一种如上所述的引物组在制备用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的试剂盒中的应用，每25μL反应体系具有以下浓度的组分：cDNA模板1μL、阳性标准品1μL、10μmol/L第一对引物0.5μL、10μmol/L第二对引物1μL、PCR预混液10μL，余量为无菌蒸馏水；所述第一对引物的序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示，所述第二对引物的序列如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜鱼弹状病毒DNA的两种质粒。本专利技术的另一目的在于还一种用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的试剂盒，包括如权利要求1所述的引物组。优选地，所述试剂盒还包括第三对引物和第四对引物，所述第三对引物的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2，所述第四对引物序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示。表1：本专利技术中的引物序列如下所示：优选地，第一对引物、第二对引物、第三对引物、第四对引物的体积均为0.5～1.5μL。优选地，第一对引物、第二对引物、第三对引物、第四对引物的体积均为0.5μL。本专利技术的有益效果在于：本专利技术可同时对染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒进行快速检测，而且可以简化操作程序、节约成本，对染性脾肾坏死病毒与鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病的流行病学调查、病原监测及早期预警都具有重要的意义。附图说明图1为单一和双重PCR电泳图(图中1表示只加入质粒P-N，引物SCRV-280-F/R后的扩增产物；2表示只加入质粒P-MCP，引物ISKNV-550-F/R后的扩增产物；3表示加入两种质粒P-N、P-MCP及两种引物SCRV-280-F/R、ISKNV-550-F/R后的扩增产物；4表示阴性对照)；图2为SCRV标准质粒电泳图(图中1表示加入质粒P-N，引物SCRV-QY-N-F/R后的扩增产物；2表示阴性对照)；图3为ISKNV标准质粒电泳图(图中1表示加入质粒P-MCP，引物ISKNV-1300MCP-F/R后的扩增产物；2表示阴性对照)；图4为不同退火温度对双重PCR反应的影响电泳图(图中1～12表示退火温度分别为54℃～65℃；13表示阴性对照)；图5为两种特异性引物不同体积比对双重PCR反应的影响电泳图(图中1表示引物比例0.5:0.5；2表示引物比例0.5:1；3表示引物比例0.5:1.5；4表示引物比例1:0.5；5表示引物比例1:1；6表示引物比例1:1.5；7表示引物比例1.5:0.5；8表示引物比例1.5:1；9表示引物比例1.5:1.5；10表示阴性对照)；图6为双重PCR敏感性试验电泳图(图中1表示混合P-N、P-MCP原液；2～9：稀释倍数为10-1～10-8的混合质粒模板；10表示阴性对照)；图7为双重PCR特异性实验电泳图(图中1表示病毒GCRV；2表示病毒KHV；3表示病毒NNV；4表示病毒SVCV；5表示病毒SGIV；6表示病毒TiLV；7表示病毒ISKNV；8表示病毒SCRV；9表示混合P-N、P-MCP为模板的阳性对照；10为阴性对照)。图8为SCRV单一PCR检测结果的电泳图(图中1～20为临床样品；21为阳性对照；22为阴性对照)；图9为ISKNV单一PCR检测结果的电泳图(图中1～20为临床样品；21为阳性对照；22为阴性对照)；图10为SCRV与ISKNV双重PCR检测结果的电泳图(图中1～20为临床样品；21为阳性对照；22为阴性对照)。具体实施方式为了更加简洁明了的展示本专利技术的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步的详细描述。实施例11、引物的设计分析GENBANK中ISKNV的MCP基因和SCRV的N基因的序列，针对ISKNV的MCP基因设计第一对引物ISKNV-1300MCP-F/R；针对ISKNV的MCP基因的保守区域设计第二对引物ISKNV-550-F/R，序列长度550bp；针对SCRV的N基因设计第三对引物SCRV-QY-N-F/R，序列长度1290bp；针对SCRV的N基因的保守区域设计第四对引物SCRV-280-F/R，序列长度280bp。引物由广州擎科生物科技有限公司合成，序列如下所述：引物合成后，分别采用单一PCR和混合两种质粒模板、两对根据保守区域设计引物的双重PCR扩增来验证引物的特异性。PCR反应体系25μL：分别取P-N0.5μL、P-MCP1μL、混合P-N0.5μL和P-MCP1μL为模板，12.5μL2×EasyTaqPCRSuperMix，上、下游引物SCRV-280-F/R、ISKNV-550-F/R各1μL(10μmol/μL)，其余用ddH2O补全。设立阴性对照，反应参数为94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃终延伸8min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图1所示，当只含有质粒P-N时，PCR只能扩出280bp片段；当只含有质粒P-MCP时，PCR只能扩出550bp片段；当混合质粒P-N和P-MCP为模板时，双重PCR能同时扩出280本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包含两对引物，所述第一对引物的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，所述第二对引物序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
【技术特征摘要】
1.用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包含两对引物，所述第一对引物的序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4，所述第二对引物序列如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示。2.如权利要求1所述的引物组在制备用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的试剂盒中的应用，其特征在于，每25μL反应体系具有以下浓度的组分：cDNA模板1μL、阳性标准品1μL、10μmol/L第一对引物0.5μL、10μmol/L第二对引物1μL、PCR预混液10μL，余量为无菌蒸馏水；所述第一对引物的序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示，所述第二对引物的序列如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示，所述阳性标准品为含有鳜传染性脾肾坏死病毒和...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁红茹，范芷仪，蔡秀珠，李宁求，林强，付小哲，刘礼辉，黄志斌，牛银杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
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